（3）共价键结合：固定化金属离子与蛋白质表面含硫基团作用形成共价键。
蛋白质与金属离子亲和力不同可用Pearson的软硬酸碱理论来解释[101]。该理论认为两个原子相互作用成键时，其中一个原子作为路易斯酸，另一个作为路易斯碱。根据软硬酸碱理论，金属离子如K+、Ca2+、Mg2+、Fe3+属于硬酸；单价金属离子如Ag+、Cu+归类为软酸；过渡态金属离子如Cu2+、Co2+、Ni2+、Zn2+属于中间酸。相应的，与金属离子结合的配基如氨基酸或蛋白质可分为三类碱，其中含氧原子(如羧基)、脂肪族的氮原子(如天冬氨酸和谷氨酸)和磷原子(如磷酸化的氨基酸)的配基属于硬碱；含硫原子(如半胱氨酸)的配基属于软碱；含芳香族氮原子(如组氨酸、色氨酸)的配基属于中间碱。中间酸Cu2+、Co2+、Ni2+、Zn2+可与含芳香族氮原子(如组氨酸、色氨酸)的中间碱以及半胱氨酸结合。由于蛋白质表面裸露氨基酸中半胱氨酸极少，因此组氨酸残基是与过渡态金属离子结合的主要基团[102]。
六聚组氨酸融合蛋白在金属螯合亲和层析介质表面结合和解离流程如下：
（1）将螯合配基以共价结合的方式固定在固相载体上。
（2）加入含有金属离子如Co2+、Ni2+的溶液，金属离子会与螯合配基形成配位键而固定在固相载体上。
（3）加入含有六聚组氨酸融合蛋白的溶液或发酵液，使六聚组氨酸融合蛋白与金属离子间以配位键方式结合在固相载体上，而与金属离子没有作用力的蛋白被分离出去。
（4）洗脱结合在固相载体上的六聚组氨酸融合蛋白。对金属螯合亲和层析介质上所结合的六聚组氨酸融合蛋白常用pH值(pH 4～5)或含咪唑的溶液进行洗脱，低pH可减弱蛋白和金属离子的相互作用，使六聚组氨酸融合蛋白得以洗脱，而咪唑是竞争性取代剂，可置换结合在介质上的六聚组氨酸融合蛋白，较低的pH和咪唑互相配合可更好地使六聚组氨酸融合蛋白被洗脱[103]。
3）金属离子的选择
金属离子的配位数直接影响其与螯合配基及生物分子的结合，配位数既要保证能与螯合配基形成稳定的化合物，又要保证有剩余的位点与目标蛋白的氨基酸残基结合。由于金属离子所带电荷、离子半径等不同，对蛋白质呈现不同亲和力，目前常用金属离子有Cu2+、Co2+、Ni2+、Zn2+等，它们具有相同电荷，离子半径分别为69、72、74和74pm。半径越小，配位作用越强，与蛋白质形成的络合物越稳定。因此，Cu2+对蛋白质结合力最强，Ni2+次之，Co2+和Zn2+结合相对较弱[104]。
4）金属螯合亲和层析用于生物分离纯化
1975年，Porath[72]首次用IMAC吸附牛血清蛋白，至今用IMAC已成功分离纯化出数百种生物大分子。IMAC分离技术除用于生物分离纯化外，还用于蛋白质的复性和空间定位、酶的固定化和金属离子清除等。
IMAC在生物分离纯化方面的优点：①结合力强，蛋白结合容量大，可用于工业生产，如采用IMAC吸附介质的扩张床吸附(EBA)技术可从哺乳动物细胞培养粗提物中一步分离纯化溶解性目标蛋白[105,106]；②洗脱条件温和，再生后配体恢复完全，一种IMAC树脂可再生几百次而不改变其层析特性[107]；③价格便宜；④可通过改装各种金属离子，引入目标蛋白质最适宜的金属离子进行不同蛋白质的纯化。鉴于上述特点，IMAC不仅适用于某些蛋白质、酶、氨基酸及肽的分离纯化[108]，也适用于可逆螯合金属离子的核苷酸[109]、激素[110]、抗体[111]等物质的分离和纯化。
目前，基因工程重组蛋白纯化技术己经成熟，常通过DNA重组技术对蛋白进行标记，该方法在重组蛋白质表达过程中巧妙地将标签(常为6×His尾巴)直接连接到蛋白质的N-末端或C-末端，这种基因工程蛋白与裂解液中的其他蛋白质相比，对金属离子有更高的特异性，在分离纯化后再用化学法或酶法将尾巴切掉。这种方法目前已经成为基因工程下游技术中对融合蛋白纯化最常用的方法。国外公司已推出商品化试剂盒，美国Qiagen公司提供的QIAexpress系统就是较为经典的一种。该系统利用的pQE系列载体不仅有6个His编码序列还含有强启动子和多克隆位点等组成，可将目的基因在宿主细胞中高效表达。表达后的产物可直接用金属螯合亲和层析进行分离，有时可实现一步纯化。金属螯合亲和层析过程既可以在常规的非变性条件下进行纯化，还可以用于变性条件(6 mol/L盐酸胍或8 mol/L尿素)纯化，这对以包涵体形式存在的重组蛋白尤为有利。
