4）融合标签技术在其他领域的应用
融合标签可提高重组蛋白的产量，由于外源蛋白质对于宿主菌的异质性，当外源蛋白质在宿主菌内表达时，宿主菌会调动各种机制来阻止外源蛋白质过量表达，导致的直接后果就是我们所需要的目标蛋白质表达量降低。近几年的研究发现，当外源蛋白质融合某些特定的标签后，能够有效增加重组蛋白质的产量[88-90]。
融合标签还可增强重组蛋白质的可溶性，外源蛋白质在宿主菌内表达时大多以包涵体形式存在[91]，致使很难获得大量有活性的天然蛋白质。为了防止包涵体形成，一般可以采用低温诱导表达蛋白质，但这种方法并非对所有蛋白质都有效。研究发现，一些高度可溶的蛋白质在与其他蛋白质融合后会促进融合蛋白质以可溶形式表达，如MBP等[92,93]。
2.5.2 金属螯合亲和层析技术
1）金属螯合亲和层析技术的发展
1948年，Hearon发现水溶液中组氨酸和半胱氨酸可与Cu2+，Zn2+形成稳定的复合物。研究还发现，固定在凝胶上的金属离子Cu2+或Zn2+可与蛋白质表面裸露有咪唑基或巯基的氨基酸残基结合。因此，含有金属离子Cu2+或Zn2+的凝胶可用来选择性吸附表面含有组氨酸或半胱氨酸的多肽或蛋白质。
1961年，Hellferich提出以固定于载体的金属离子来分离小分子的概念，称为配基交换层析(ligand exchange chromatography，LEC)[94,95]。
1975年，Poroth首次提出“固定化金属螯合亲和层析(Immobilized Metal-Chelated Affinity Chromatography，IMAC)”的概念[72]，首次成功地在琼脂糖凝胶上偶联了螯合配基亚氨基二乙酸(IDA)。IDA与金属离子如Cu2+螯合后，可与蛋白质结合，不同组成的蛋白质与金属离子结合力不同，据此将蛋白质进行分离。最常用的金属离子包括Cu2+，Ni2+，Zn2+和Co2+等过渡态金属离子。不同蛋白质分子内的组氨酸、半胱氨酸以及色氨酸等残基种类、数量、位置和空间构象不同，因而与金属配基的亲和力大小不同，从而可选择性地加以分离纯化。
1987年，Hochuli等[96]在目标蛋白质末端接上六聚组氨酸多肽得到纯化的重组蛋白质。此后六个组氨酸标签广泛应用于重组蛋白质的纯化。近年来，原核生物表达的重组蛋白质已有50%以上都是通过末端接有六聚组氨酸多肽而被纯化出来[97]。
目前，固定化金属螯合亲和层析技术已成为蛋白质，特别是基因重组蛋白和多肽分离纯化最有效的工具之一。
2）金属螯合亲和层析作用原理
固定化金属螯合亲和层析基于蛋白质表面氨基酸与固定化金属离子的亲和力不同对蛋白质进行分离。金属螯合亲和介质与蛋白质的作用如图2.1所示。过渡态金属离子能与电子供体氮、硫、氧等原子以配位键结合，金属离子上剩余的空轨道是电子供体的配位点，在溶液中被水分子或阴离子占据。当蛋白质表面氨基酸残基与金属离子的结合力较强时，氨基酸残基的供电原子(如组氨酸残基的N原子、半胱氨酸残基的S原子)将取代与金属离子结合的水分子或阴离子，与金属离子形成复合物，从而使蛋白质分子结合在固相介质表面。氨基酸中的α-氨基和α-羧基，以及某些氨基酸侧链基团含有孤对电子的活性原子都能参与螯合反应，由于蛋白质表面这些氨基酸的种类、数量、位置和空间构象不同，因而与金属配基的亲和力大小不同，从而可选择性地加以分离纯化[98]。
图2.1 金属螯合亲和介质与蛋白质的作用
生物分子与金属离子间的结合强度与它们的轨道重叠程度有关，结合作用可分为三种[99-100]：
（1）静电吸引：修饰后的基质带有净负电荷，它可吸附分离表面氨基酸残基带正电荷的蛋白质。
（2）配位键结合：蛋白质表面的组氨酸、色氨酸、半胱氨酸等残基上有咪唑基、吲哚基、巯基等，其氮原子、硫原子上未共用电子对与固定化金属离子形成配位键。
