酶将染色体DNA切割成片段，与适当的克隆载体连接后 转入受体菌扩增，即获得基因组DNA文库，用核酸探针将所需目的基因从基因文库中―钓‖取出来。（4）从文库中筛选cDNA：提取mRNA，利用反转录酶 合成与其互补的DNA（cDNA）分子，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，即获得cDNA文库，然后采用适当方法从cDNA文库中 筛选出目的cDNA。（5）用PCR从基因组DNA或cDNA中扩增目的基因。
125.------------------返回试题
[答] DNA重组载体应具备的条件：（1）能自主复制；（2）具有一种或多种限制性内切酶的单一切割位点，并在位点中插入外源基因后，不影响其复制功能；（3） 具有1～2个筛选标记；（4）克隆载体必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，并且不会任意转入其他生物细胞；（5）易于操作，转化效率高。常用的 基因载体有以下几种：（1）质粒：是细菌染色体以外的小型环状双链DNA分子，本身有复制功能，且带有某些选择信息，但可插入的目的基因片段较小。（2） 噬菌体DNA：是一种病毒DNA，能插入比较大的外源DNA片段，在DNA分子上有多种限制性核酸内切酶识别位点，便于多种外源DNA酶切片段的克 隆。（4）柯斯质粒载体和酵母人工染色体：前者结合了质粒和 噬菌体载体的优点，也是一种环形双链DNA分子，具有质粒的性质，可以转化大肠杆菌，并自行复制和增殖，但它不会产生子代噬菌体，构建成的此种载体较小， 因此能插入比较大的外源DNA片段，所以被广泛地用于构建基因组文库。后者既含有大肠杆菌来源的质粒复制起始位点，又含有酵母菌染色体DNA着丝点，端粒 和复制起始位点的序列，以及合适的选择标记基因，可在转化的酵母菌细胞内，按染色体DNA复制的形式复制重组DNA，容纳外源DNA片段的能力比前3种载 体大得多。
126.------------------返回试题
[答] 基因克隆（gene cloning）是指含有单一DNA重组体的无性系或指将DNA重组体引进受体细胞中，建立无性系的过程。一个完整的基因克隆过程包括：（1）选择合适的 目的基因和栽体；（2）用限制性内切酶处理目的基因和栽体；（3）连接目的基因与栽体；（4）将重组体导入受体细胞。（5）筛选转化细胞并扩大培养。基因 克隆技术可用于构建基因组文库和cDNA文库，也可以用于克隆某一特定的基因，对其进行序列分析和功能研究。
127.------------------返回试题 [答] （1）有适宜的选择标志；（2）具有能调控转录、产生大量mRNA的强启动子，如lac启动子或其他启动子系列；（3）含适当的翻译控制序列，如核糖体结合位点和翻译起始点等；（4）含有合理设计的多接头克隆位点，以确保目的基因按一定方向与载体正确衔接。
128.------------------返回试题
[答] 在转基因操作以后，载体只能进入部分宿主细胞，即使含有载体的细胞，也并非都含有目的基因，有些宿主细胞可能含有自身连接成环的载体分子或非目的基因与载 体形成的重组体。因此，须在不同层次不同水平上进行筛选和鉴定，以确定哪一菌落所含的重组DNA分子确实带有目的基因，这一过程为筛选。根据载体体系、宿 主细胞特性及外源基因在受体细胞表达情况的不同，可采用：（1）直接选择法：针对载体携带某种或某些标志基因和目的基因，直接测定该基因或基因表型的方 法。a.抗药标志的筛选：
载体具有某种抗生素的抗性基因，在转化后只有含载体的细菌才能在含该抗生素的培养平板上生长并形成单菌落，而未转化细胞则不能生 长，这样即可将转化菌与非转化菌区别开来。b.插入失活法：将目的基因插入载体某一耐药基因内使该基因失活，可区分单纯载体或重组载体（含目的基因）的转 化菌落。如pBR322含ampr、Tetr双抗药基因，若将目的基因插入载体的Tetr基因中，则含目的基因的转化细胞只能在含Amp的培养液中生长， 而不能在含Tet的培养液中生长。c.标志补救：若克隆的基因能在宿主菌表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷互补，那么就可以利用营养突变菌株进行筛选， 这称为标志补救。如重组体为亮氨酸自养型（Leu+），将重组子导入亮氨酸异养型（Leu-）的宿主细胞后，在不含Leu的培养液中可生长，而不含重组体 的细胞则不能生长。 -互补法筛选（见43题）也是一种标志补救选择方法。d.酶切图谱筛选：分别挑取独立的菌落，培养后快速提取重组体DNA，用重组时所采用的限制酶切割 后，进行琼脂糖凝胶电泳，可以从DNA片段的大小和有无判断所选的菌落是否为阳性克隆。e.核酸杂交筛选：将转化子DNA或克隆的DNA分子片段转移至合 适的膜上，利用标记探针进行杂交，直接选择并鉴定目的基因。f.原位杂交筛选：是将待选菌在平板上培养成菌落，按相应位置（原位）转移至合适的膜上，经变 性使膜上的DNA成单链，再与标记的探针（与目的基因互补）杂交，找出平板上的菌落位置，即为重组的阳性菌落。（2）免疫学方法筛选：利用特异抗体与目的 基因表达产物的特异相互作用进行筛选。这种方法不直接鉴定基因，属非直接筛选法。分为免疫化学方法及酶联免疫检测分析等。基本的工作原理是将琼脂培养板上 的转化子菌落经氯仿蒸汽裂解、释放抗原，再将固定有抗血清的膜覆盖在裂解菌落上，在膜上得到抗原抗体复合物，最后用合适的方法检出阳性反应菌落。
129.------------------返回试题
[答] -半乳糖苷酶的N端可以进行修饰，有时并不影响酶的活性或 肽的互补性。如果插入的外源DNA引起 肽的可读框的改变，或者插入片段在正确的可读框中含有终止密码的话，就会形成白色菌落或噬菌斑。如果插入DNA的碱基数正好是3的倍数，或者插入的DNA 中不含有终止密码的话，仍然会形成蓝色噬菌斑。这种插入物的长度可达几百个碱基对。M13载体的这种性质可以用来检测和选择产生新终止密码的突变，也可以 用来检测移码突变。
130.------------------返回试题
[答] （1）将重组质粒导入原核细胞称转化，通常用氯化钙法使大肠杆菌细胞处于感受态，从而将外源DNA导入细胞。另一个常用方法是用脉冲高压电瞬间处理，使外 源DNA高效导入细胞，称为电穿孔法。(2)将重组体DNA包装成噬菌体，使外源基因导入宿主细胞称转导，在适宜条件下使转化率提高。（3）将外源基因导 入动物细胞常用方法有磷酸钙转染技术，电穿孔转染技术，脂质体载体法，DEAE-葡聚糖转染技术，显微注射法等。将外源基因导入植物细胞常用方法是用Ti 质粒将外源基因导入植物的外植体，也可将植物细胞的细胞壁消化，再用将外源基因导入动物细胞常用方法将外源基因导入原生质体，再诱导产生细胞壁。还有一个 方法，是用基因枪将外源DNA射入植物组织或细胞。
131.------------------返回试题
[答] （1）外源基因的活性蛋白质第一个氨基酸可能不是甲硫氨酸，表达融合蛋白有利于肽链合成的起始。（2）蛋白质的N端序列对其合成和折叠有较大影响，如外源 基因
在宿主细胞内表达量过低，将其与宿主细胞表达基因N端序列融合，可以提高表达水平。（3）外源蛋白在宿主细胞内往往不稳定，易被宿主细胞蛋白酶降解， 含有宿主蛋白N端序列的融合蛋白则比较稳定。（4）融合蛋白不影响某些表位结构，可用于抗体工程。（5）某些融合蛋白易于分离纯化和检测。
132.------------------返回试题
[答] 目前常用的定位诱变方法主要有：（1）酶切诱变：先选择合适的限制酶将基因切开，然后插入或删除有关序列，可以在切点处改造基因序列。（2）寡核苷酸指导 的诱变：a.制备单链DNA模板；b.合成诱变寡核苷酸；c.寡核苷酸与模板退火并合成异源双链DNA；d.将异源双链DNA插入合适的载体；e.转染宿 主细胞；f.筛选和鉴定突变体。（3）PCR诱变：在引物中引入非配对碱基，通过PCR引物可以在扩增产物中引入点突变，嵌套式PCR还可以在基因内部或 在一次PCR中同时在多处引入变异。各种变异，包括插入、删除、置换和重组，都可用PCR的方法来进行。
133.------------------返回试题
[答] 蛋白质工程是通过对蛋白质及酶的化学修饰及基因改造获得具有特殊功能的非天然蛋白质的技术。主要是根据蛋白质的结构和功能间的相互关系，利用基因工程技术，或用化学方法合成基因、改造基因，以便合成新的蛋白质，或改变蛋白质的活性、功能以及溶解性等。
几乎所有类型具有开发前景的蛋白质和多肽均有用蛋白质工程改造的尝试，并取得不同程度的成果。例如，水蛭素是水蛭唾液腺分泌的凝血酶特异抑制剂，它有多种 变异体，由65或66个氨基酸组成。水蛭素在临床上可作为抗血栓药物用于治疗血栓病。为提高水蛭素活性，在综合各变异体结构特点的基础上提出改造水蛭素， 将47位的Asn变为Lys，使其与分子内Thr4或Asp5间形成氢键来帮助水蛭素N端肽段正确取向，从而提高抗凝血效率，试管实验提高达4倍，在动物 模型上检验抗血栓形成的效果提高20倍。
1．水解肽A时,发现其含有等量的Arg,Val,Tyr,Glu,Lys,Ala和Gly七种氨基酸 (6分) (1) 肽A用DNFB法分析N端氨基酸，产生出DNP-Ala
(2) 肽A用羧肽酶短时间处理产生游离的Glu是第一个可鉴定的氨基酸
(3) 用胰蛋白酶水解肽A时,得到如下物质：Arg，Ala-Lys和含有Glu,Gly,Tyr,Val的肽B; (4) 用胰凝乳蛋白酶水解肽B，产生两个二肽：Val-Tyr和Gly-Glu 问该肽A的氨基酸排列顺序是怎样的?
