注意这些能量在计算中假定了具有相同的背景状态； 换句话说，在氨基酸带电和不带电状态这个问题上，蛋白质中其它的可滴定基团也采用了相同的状态。稍后我们会讨论这个假设的含义。
7.2.3. 蛋白质pKa计算的连续静电方法
虽然几乎任何自由能方法都可以用来计算将质子化和未质子化的氨基酸从溶剂转移到蛋白质环境时的能量，但连续静电方法是（通常）一个在精度和计算效率上令人满意的折衷方法。 需要计算的迁移自由能，ΔxferGHA 和 ΔxferGA-，可从Poisson-Boltzmann (PB)能量决定。特别地，这些能量可作为有效的“结合能计算”来进行计算，与APBS 示例和教程中的能量计算相似: Equation 7.2. 迁移自由能
其中
? ? ?
Gprotein with charged X 是蛋白结合了基团Ｘ的静电能，其中基团Ｘ上的所有电荷设为正常值。
Gprotein with uncharged X是蛋白结合了基团Ｘ的静电能，其中基团Ｘ上的所有电荷设为０。 Gcharged X in solution 是溶剂中基团Ｘ的静电能，其中所有电荷设为正常值。 注意，与结合能一样，Equation 7.2, “迁移自由能” 可有两种方式来衡量：
衡量迁移自由能的方法
?
?
直接在PB方程中，计算各个状态下PB计算结果减去总静电能(包括自身作用能)值。为了使得这项工作能进行，在每一个PB计算中所有构象/格点位置/电荷状态必须相同。 间接地，可通过溶剂化自由能的PB计算和静电相互作用能的库仑定律计算（在介电常数为εp下）实现。 对于一个好的有效格点设置，这个方法更稳定。
通过自由能循环，两种方法都可以给出所需的 ΔxferGX。然而，考虑到所有计算都使用了相同的格点和构象， 使用总静电能的直接方法通常是最有效的。
注意上面讨论的两种方法都没有明确的允许在我们研究的酸性集团质子化/去质子化的过程中可以改变蛋白质中其它集团的滴定状态。另外，这两种方法都没有明确地提供与质子化/去质子化相伴随的蛋白质构象变化。因为如此，用这种方法我们不能计算真实的pKa 值。我们计算的是内禀pKa 值。 7.3. 应用于溶菌酶
7.3.1. 背景
鸡蛋白溶菌酶 (HEWL)是pKa 计算的常用的体系，因为它的可滴定残基有许多有意思的值。 关于此酶 pKa 的早期研究工作可参见 Tanford C, Roxby R. Interpretation of protein titration curves. Application to lysozyme. Biochemistry. 11 (11), 2192-8, 1972 ，其中也有这个实验室使用的pKa 值。更多关于近来的pKa 计算和许多方法的综述可见Nielsen JE, Vriend G. Optimizing the hydrogen-bond network in Poisson-Boltzmann equation-based pk(a) calculations. Proteins-Structure Function and Genetics. 43 (4), 403-12, 2001。最后，溶菌酶的生物相关性在Wikipedia中作了简要概述。
HEWL有两个活性位点残基 ，即GLU 35和ASP 52 。它们的滴定状态决定了酶的催化能力： Figure 7.2. HEWL的活性位点
特别地，只有在ASP 52 离子化(pKa ≈ 1.2)和GLU 35呈中性(pKa = 6.3)的情况下HEWL才有活性。
另外，溶菌酶中ASP 66 pKa 值是6.6 ，HIS 15 pKa 值是5.7。 7.3.2. 概况和声明
下面，我们将演示确定GLU35内禀pKa 的步骤。然而，这项工作实际上不能很好地完成(你需要找到原因！)。因此，对HIS15 和ASP66你也需要进行相同的操作，以获得计算连续溶剂pKa的更好示例。 7.3.3. 准备PDB 文件
从PDB 下载2LZT ，以2LZT-GLU35.pdb保存。如果你有时间，你也应该访问PDBSum 分析页面以获得更多关于结构的信息。
水分子会出问题!
在继续操作之前，将PDB中所有水分子移除。这是非常重要的。（为什么？）
为进行pKa 计算，我们将需要获得GLU 35质子化的形式。我们将通过PDB2PQR web service来实现。 PDB2PQR 可进行一系列操作来“整理” PDB 文件，使其适于静电计算。这些操作在PDB2PQR homepage里做了描述。
如果没有特定要求， PDB2PQR 会基于模型pKa 值向残基上加氢。因此，我们需要将谷氨酸残基名由GLU 改为 GLH ，这样就指定了GLU 35的滴定状态。可使用我最喜欢的文本编辑器进行修改，将结果以2LZT-GLH35.pdb 保存。
现在我们准备好了运行PDB2PQR ，来使我们的PDB 文件变为质子化的形式。使用命令行版本的PDB2PQR或者PDB2PQR homepage 列出的网络服务器来生成2LZT-GLU35.pdb 和 2LZT-GLH35.pdb 的质子化PQR文件。将结果分别命名为2LZT-GLU35.pqr 和2LZT-GLH35.pqr。虽然考查结果对不同力场的敏感度是重要的，我推荐现在使用PARSE。
注意
你可以使用PDB2PQR中的 PROPKA 来定义滴定状态。但是上面的步骤不要这么做，因为我们需要为我们的计算设定精确的滴定状态。
为进行内禀pKa 的静电计算，我们将需要孤立的氨基酸残基。使用你喜欢的文本编辑器由2LZT-GLU35.pqr 和2LZT-GLH35.pqr生成GLU 35 或GLH 35 残基格式。将结果分别以GLU35.pqr 和 GLH35.pqr保存。
最后，我们也需要对具有不带电荷残基的HEWL进行静电计算。使用你喜欢的文本编辑器将 2LZT-GLU35.pqr 和 2LZT-GLH35.pqr 中的电荷设为0，生成2LZT-noGLU35.pqr 和2LZT-noGLH35.pqr。 这可以通过将PQR文件中倒数第二行设为0来实现，例如： ATOM 534 N GLU 35 6.456 16.408 22.487 -0.5163 1.8240 ATOM 535 CA GLU 35 6.354 15.205 23.349 0.0397 1.9080 ATOM 536 C GLU 35 6.889 13.941 22.695 0.5366 1.9080 ATOM 537 O GLU 35 7.705 13.192 23.277 -0.5819 1.6612 ATOM 538 CB GLU 35 4.906 14.973 23.796 0.0560 1.9080 ATOM 539 CG GLU 35 4.476 15.932 24.948 0.0136 1.9080 ATOM 540 CD GLU 35 5.171 15.736 26.255 0.8054 1.9080
ATOM 541 OE1 GLU 35 5.844 14.786 26.570 -0.8188 1.6612 ATOM 542 OE2 GLU 35 5.038 16.682 27.056 -0.8188 1.6612 ATOM 543 H GLU 35 5.671 16.799 22.056 0.2936 0.6000 ATOM 544 HA GLU 35 6.856 15.382 24.215 0.1105 1.3870 ATOM 545 HB2 GLU 35 4.318 15.158 23.042 -0.0173 1.4870 ATOM 546 HB3 GLU 35 4.832 14.066 24.142 -0.0173 1.4870 ATOM 547 HG2 GLU 35 4.654 16.857 24.629 -0.0425 1.4870 ATOM 548 HG3 GLU 35 3.500 15.796 25.084 -0.0425 1.4870 可能变成
ATOM 534 N GLU 35 6.456 16.408 22.487 0.0000 1.8240 ATOM 535 CA GLU 35 6.354 15.205 23.349 0.0000 1.9080 ATOM 536 C GLU 35 6.889 13.941 22.695 0.0000 1.9080 ATOM 537 O GLU 35 7.705 13.192 23.277 0.0000 1.6612 ATOM 538 CB GLU 35 4.906 14.973 23.796 0.0000 1.9080 ATOM 539 CG GLU 35 4.476 15.932 24.948 0.0000 1.9080 ATOM 540 CD GLU 35 5.171 15.736 26.255 0.0000 1.9080 ATOM 541 OE1 GLU 35 5.844 14.786 26.570 0.0000 1.6612 ATOM 542 OE2 GLU 35 5.038 16.682 27.056 0.0000 1.6612 ATOM 543 H GLU 35 5.671 16.799 22.056 0.0000 0.6000 ATOM 544 HA GLU 35 6.856 15.382 24.215 0.0000 1.3870 ATOM 545 HB2 GLU 35 4.318 15.158 23.042 0.0000 1.4870 ATOM 546 HB3 GLU 35 4.832 14.066 24.142 0.0000 1.4870 ATOM 547 HG2 GLU 35 4.654 16.857 24.629 0.0000 1.4870 ATOM 548 HG3 GLU 35 3.500 15.796 25.084 0.0000 1.4870 7.3.4. 启动总静电能计算
我们将使用focusing calculations来计算体系的静电势能和自由能。
提示
下面， 我们将计算总静电自由能 – 比如， 包括自身电荷相互作用项的能量。在接下
来的步骤里计算溶剂化或迁移自由能时，我们将去掉这些自身相互作用项。因此，在每个计算中要使用相同的格点参数(格点中心、大小、空间分布等)，这是非常重要的。
下面是我们计算每个溶剂化能使用的输入文件模板(从这里下载 here):
read mol pqr compound.pqr # This is the compound for which we will calculate solvation energies mol pqr ref.pqr # This is a compound used as a reference for grid centering end
elec name inhom mg-auto # Focusing calculations dime 129 129 129 # This is a good grid spacing for this system cglen 52.0 66.0 79.0 # These are reasonable coarse grid settings for this system (PDB2PQR-recommended) fglen 51.0 59.0 67.0 # These are reasonable fine grid settings for this system (PDB2PQR-recommended) cgcent mol 2 # Center the grid on the reference molecule fgcent mol 2 # Center the grid on the reference molecule mol 1 lpbe bcfl sdh pdie 20.00 sdie 78.54 srfm smol sdens 40.0 chgm spl2 srad 1.40 swin 0.30 temp 298.15 calcenergy total calcforce no end
# Print the final energy print energy inhom end quit 关于此输入文件，许多方面需要注意：
? ? ?
一般地，每个计算的compound.pqr 将会改变，但ref.pqr 则不会。 选择一个分子
作为ref.pqr (2LZT-GLU35.pqr 是一个好的选择) ，在所有计算中使用它。 我们使用的溶质介电常数(εp)是20 (见 pdie)。对PKa计算来说这个选择是常用的[8] ，因为一般认为它暗含了溶质的内部松弛度和重排[9]。
对于分子表面 (srfm smol) ，我们使用了一个合理的高表面离散点密度(sdens 40.0)。pKa 和其它静电结果对表面选取有时是非常敏感的。
现在你有了足够的信息来计算相关分子的总静电能量: 2LZT-GLU35.pqr，2LZT-GLH35.pqr， 2LZT-noGLU35.pqr， 2LZT-noGLH35.pqr， GLU35.pqr， and GLH35.pqr。通过修改上面的模板，你应该能够为这些体系分别构建APBS输入文件。当这些输入文件构建好后，你可通过以下命令运行PB 计算：
