第14卷第2期高产果胶酶菌株的筛选鉴定及其发酵条件研究139
悬液。取悬液1mL于富集培养基中30℃，200r/1.2.3.2菌株分子生物学鉴定以基因组DNA
min培养24h。对培养后的富集液进行梯度稀释，
涂布于筛选培养基中，30℃恒温培养3d，挑取单菌落进行纯化、保藏。同时用卢戈氏碘液对涂布培养后的筛选培养基进行染色，测量菌落直径与透明圈直径。挑选菌落直径与透明圈直径比值（HC比值）大的菌株进行复筛。
复筛：将初筛得到的HC比值较大的菌株接种于含50mL基础发酵培养基的250mL锥形瓶中发酵，30℃、180r/min摇床中培养3d。发酵液经4℃、8000r/min离心5min，取上清液作为粗酶液，测定其果胶酶活力，筛选出酶活力较高的菌株。
提取试剂盒提取的G1菌株基因组DNA为模板，利用18SrDNA通用引物[13]（上游引物：5′-
GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′；下游引物：5′-TC-CGCAGGTTCACCTACGGA-3′）进行PCR扩增G1
菌株的18SrDNA。将PCR扩增产物回收纯化后进行序列测定。测序结果拼接后利用Blast工具进行序列同源性分析，下载部分同源序列通过
ClustalX进行序列对位排列后，使用Mega5.05[14]软件以邻位相连（Neighbor-Joining）算法生成系统
发育进化树。系统树各分枝的置信度经重抽样法（Bootstrap）1000次重复检测。
1.2.4
果胶酶活力测定
采用DNS法测定，根据
产酶条件优化利用单因素试验优化培养
1.2.2基碳源、氮源、培养基初始pH、装液量、摇床转速、接种量以及培养温度。无特别说明，每个试验做3个平行，重复3次。优化前的发酵条件：装液量50
文献[11]进行适当修改。吸取1.5mL1%果胶溶液（用pH5.0柠檬酸缓冲液配制）加入25mL具塞比色管中，于50℃水浴预热3min后加入0.5mL适当稀释粗酶液，精确反应30min后加入2mL
mL/250mL，接种量5%，培养温度30℃，摇床转速180r/min，培养3d。
DNS，沸水浴5min，定容25mL。在波长540nm处
测定吸光值，以灭活的酶液作为空白对照，每个样品平行测定3次，结果取平均值。果胶酶活力定义：在上述反应条件下，1mL酶液每小时水解底物生成1mg半乳糖醛酸的能力，定义为1个酶活力单位（U）。
2
2.1
结果与分析
果胶酶产生菌的筛选
经筛选培养基初筛获得8株霉菌（HC值大于
1.50），分别命名为G1~G8，它们能够较好地降解
果胶。对初筛获得的菌株进行发酵培养后测定其酶活力（表1）。菌株G1相对于其它菌株具有较高
1.2.3菌株鉴定
1.2.3.1菌株形态鉴定
依据《真菌鉴定手册》进
的酶活，培养3d后酶活力达到27.9U/mL。最终挑选菌株G1做研究。
行菌落特征和菌丝体形态特征的鉴定[12]。
表1
菌株编号
果胶酶产生菌的筛选结果
菌株编号
Table1Screeningresultsofpectinase-producingmicroorganismsHC比值1.651.781.651.70
酶活力/U·mL-1
HC比值1.811.941.511.63
酶活力/U·mL-1
G1G2G3G4
27.925.621.720.8
G5G6G7G8
26.022.316.319.2
2.2菌株G1鉴定
2.2.1形态鉴定菌株G1在PDA平板上生长迅速，生长初期菌丝呈白色，第2天后出现黑色孢子，菌落呈绒毛状，背面有放射状脊（图1）。在显
微镜下观察（图2），菌丝有横隔，多分枝，部分菌
丝细胞形成特化的足细胞；分生孢子梗的末端膨大，形成球状的顶囊，顶囊上着生有初生小梗和次生小梗，小梗上着生分生孢子；分生孢子呈球形，黑色，成串生长。初步鉴定菌株G1为曲霉属。
