① 放射性核素标记:用放射性同位素标记探针,检测标记信号,采用放射性自显影法。
② 荧光染料标记:用荧光染料物质(如溴乙锭等)标记探针,检测标记信号:能直接看到荧光 或采用特殊仪器收集荧光信号信息(如基因芯片用激光共聚集扫描收集荧光信号)。
③ 生物素标记探针:用生物素标记探针。检测标记信号:生物素分子上连接有特定的酶,加入相应底物后,通过特定酶催化反应过程,产生具有一定有色的物质。
3、什么是Southern印迹?有何应用?简述Southern blotting 的基本过程原理?
答:DNA印迹(DNA blotting)也称southern blotting,是 E.Southern 最先发明使用于检测DNA,顾称之。
其具体过程原理是:
(1) 将待测DNA用限制性核酸内切酶酶切水解得到大小不同的DNA片段。
(2) 将这些片段进行琼脂糖凝胶电泳,大小不同DNA片段停留在凝胶板上的不同位置形成不同的区带。
(3) 将含不同DNA片段的凝胶板放到DNA变性溶液(如0.5mol/L NaOH等)中进行变性处理,使双DNA成为单链DNA
(4) 将凝胶板上的变性DNA转移到硝酸纤维膜(NC膜 ,Nitrocellulose)上:用多量吸水纸吸附的毛细管作用,使凝胶板上DNA转移至NC膜上,由于NC膜具有很强的吸附DNA的作用,一旦胶板上DNA转移到NC膜上时,就能牢固的吸附在膜上,并保持原来位置不发生变化。
(5) 将转移后的NC膜经80℃真空加热或紫外交联仪处理,DNA就能非常牢固的固定在NC膜上,便于进行杂交。
(6) 杂交反应:将标记的探针与NC膜进行杂交,68℃杂交12小时。
(7)杂交信息监测:放射自显影或荧光信号监测确定有无杂交体、杂交体的位置及强弱。
应用:根据探针的碱基顺序确定目的基因的碱基顺序,对相关基因进行定性分析,还能进行定量析,以及对重组质粒进行分析等。
4、什么是Northern印迹?有何应用?Northern印迹与Southern印迹有何异同?
答:RNA印迹(RNA blotting)也称Northern Blotting,其基本过程及原理与Southern blotting 相同,只是监测对象由 DNA换成 RNA。由于被检测RNA分子较小,常无需限制性内切酶来酶切。电泳RNA转移至NC膜上以及杂交信息的检测,都与Southern blotting 相同。由于RNA极不稳定,易受RNA酶降解,因此实验过程中要加入RNA酶 抑制剂DEPC(焦磷酸二乙酯,diethlpyrocarbonate)
应用:主要用于RNA定量分析
(1) 检测组织细胞中某一已知的特异 mRNA的表达水平
(2) 比较不同组织细胞中同一基因( mRNA )的表达情况
5、什么是Western印迹?有何应用?Western印迹的基本过程原理是什么? 答:蛋白质印迹常称为Western blotting(与Southern blotting, Northern blotting 相对应)。由于检测蛋白质不是用探针,而是用该蛋白质特异的相应抗