医学分子生物学复习思考题及答案(15)

2025-09-10

因等。

真核表达载体根据宿主细胞不同,又分为:酵母表达载体、昆虫表达载体、哺乳动物细胞表达载体等。

8、重组DNA技术包括哪些基本过程?如何获得目的基因?

答:一个完整的重组DNA过程包括五大步骤,简称为:

分、选、接、转、筛

(一)目的基因的分离获得—分

1、人工化学合成法:用DNA自动合成仪合成,主要用于小片段DNA合成,若基因片段太长,先分段合成后再连接成长片段基因。

2、从基因文库中获得:从基因组文库及cDNA文库中,采用核酸杂交等方法获取目的基因。

3、PCR法:是目前最常用的方法,根据目的基因两端的碱基顺序合成一对引物,经PCR扩增获得目的基因。

4、其它方法:如酵母杂交法系统克隆得与蛋白质特异相互作用的基因等。

9、如何选择基因载体?

答:载体的选择与构建—选

DNA克隆目的主要有二个:

① 获得目的DNA片段的大量拷贝

② 获得目的DNA片段的表达产物蛋白质。

针对目的①应选用克隆载体。针对目的②

应选用表达载体

此外,还要根据目的DNA片段大小,受体细胞的种类、来源等对载体进行选择。有的克隆过程要求载体上有多克隆位点(MCS)

10、目的DNA与基因载体的连接方法有哪些?试述之

答:1、粘端连接法(粘性末端链接法)

(1)单一相同粘端链接法:用同一种限制性核酸内切酶(RE)切割目的DNA及载体DNA,产生完全相同的单链互补粘性末端,然后由连接酶催化将目的DNA与载体DNA连接起来。

(2)不同粘端连接法:用两种不同的RE酶切目的DNA及载体DNA。结果,目的DNA及载体DNA的两端就可产生两个不同的粘端,于是目的DNA就能定向的插入载体中。这种使目的DNA按特定方向插入载体的克隆方法。称之为定向克隆(directed cloning).

(3)其它粘端连接法

① 人工接头法:人工合成含有某种RE酶切位点的双链寡核苷酸称之为接头(adaptor),然后将此接头与目的DNA连接起来。用同一种RE酶切带接头的目的DNA及载体DNA,产生单一相同粘端,再由连接酶催化将二者连接。

②同聚物尾法:在末端转移酶催化下,将一种核苷酸(如dc)逐一连接在目的DNA的3’端,形成同聚物尾。用同样方法将另一互补核苷酸(如dG)逐一连接在载体DNA的3’端,形成互补的同聚物尾,于是粘端连接法将二者连接起来。 ③ PCR法:针对目的DNA两端设计合成一对特异性引物,在每条引物的5’端分别连接上不同的RE的酶切位点。当用这种引物以目的DNA为模板进行PCR扩增时,得到的扩增物目的DNA的两端就分别含有不同RE的酶切位点。用这两种不同的RE酶切目的DNA及载体DNA,于是,目的DNA就能定向插入到载体DNA中。

2、平端连接法


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