标记死细胞的核酸。
选择合适的探针浓度，防止非特异性标记。合理设置对照，识别结果中的假阳性或假阴性。
保持样品应有的结构形态完整性。 荧光强度适宜、具有可重复性。 注意荧光稳定性
光敏效应弱：主要表现为在光的作用下，荧光探针发生荧光淬灭或增强。照射光强度越大、波长越短，则光敏现象越严重。例如：强光照射下荧光探针FITC易淬灭，而DCFH则会发生荧光增强。
环境因素：探针所在介质的温度、组成成分（pH、淬灭剂的浓度等） 样品中多重荧光之间的相互影响
光漂白性：激发光的强度超过一定限度时，光吸收趋于饱和，并不可逆地破坏激发态分子。
图像背景低、非特异性染色少
尽早上机采集图像。防止荧光探针被排出细胞、荧光淬灭及细胞干燥等导致的荧光变化。 激光共聚焦显微镜的用途
（一）细胞或组织内核酸的定位、定性 （二）蛋白质的定位、定性 （三）细胞内离子的测定
（四）膜电位五、细胞内活性氧 （六）细胞间通讯 （七）解笼锁
（八） 荧光能量共振转移 （九）细胞、亚细胞结构 间接免疫荧光法基本原理 影响抗原抗体反应的因素 抗原抗体本身的因素： 抗原：
抗原的理化性状、表面抗原决定簇的种类和数目等均可影响抗原抗体反应的结果。 抗体：
? 来源 不同动物来源的免疫血清，其反应性存在差异。尤其是其Fc段不同，需用不同的二抗。
? 浓度 抗体的浓度过低，抗原抗体不能结合，过高抗原抗体会发生非特异性结合，一般选取尽可能低的浓度保证抗原抗体结合的特异性。
? 特异性与亲和力 抗体应尽可能选择高特异性、高亲和力的抗体，以保证试验的可靠性。
反应环境因素： 电解质 酸碱度 反应时间 振荡和搅拌 温度
一般以15～40℃为宜，最佳反应温度为37℃，在此范围内，温度升高可加速分子运动，抗原与抗体碰撞机会增多，使反应加速。但若温度高于56℃时，可导致已结合的抗原抗体再解离，甚至变性或破坏；温度越低，结合速度越慢，但结合牢固。 凋亡的共聚焦检测方法 观察细胞膜、核形态 凋亡小体
检测DNA断端的TUNEL法
凋亡早期细胞膜损伤的Annexin-V法
CFP(蓝色)位于内质网、CGFP（绿色）位于细胞核、GFP（黄色）位于质膜、YFP（红色）位于线粒体
三重荧光图像与透射光图像共定位意示图
