多在抗原分子内
主要由T识别，B也可识别 构象决定簇：
序列上不相连，由天然构象形成 位于分子内部 由B识别
功能决定簇和隐蔽决定簇
功能性抗原决定簇：位于表面的、易被抗体及淋巴细胞识别的、可启动免疫应答的决定簇的免疫优势集团
隐蔽性抗原决定簇：为于分子内部的，不能引起免疫应答的决定簇 功能决定簇和隐蔽决定簇
氨基酸残基在侧链的位置不同，其免疫原性不同。 抗原抗体反应的原理
抗原抗体反应:指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。 物质基础:
抗原表位与抗体高变区间的互补结合
抗原表位与抗体高变区的沟槽分子表面的结合 抗原抗体之间的结合力 电荷引力（静电引力） 范登华引力 氢键结合力 疏水作用力
1. 电荷引力（库伦引力或静电引力）:
抗原抗体分子带有相反电荷的氨基和羧基基团之间相互吸引的力.
例如，一方在赖氨酸离解层带有阳离子化的氨基残基（-NH3 + ），另一方在天门冬氨酸电离后带有阴离子化的羧基（-COO- ）时，即可产生静电引力，两者相互吸引，可促进结合。这种引力和两个电荷间的距离的平方成反比。两个电荷越接近，静电引力越强。反之，这种引力便很微弱。 2.范登华引力:
原子与原子、分子与分子互相接近时发生的一种吸引力，实际上也是电荷引起的引力。
由于抗原与抗体两个不同的大分子外层轨道上电子之间相互作
用，使得两者电子云中的偶极摆动而产生吸引力，促使抗原抗体相互结合。这种引力的能量小于静电引力。 3.氢键结合力:
氢键是由分子中的氢原子和电负性大的原子如氮、氧等相互吸引而形成的。当具有亲水基团（例如-OH,-NH2 及 -COOH）的抗体与相对应的抗原彼此接近时，可形成氢键桥梁，使抗原与抗体相互结合。氢键结合力较范登华引力强，并更具有特异性，因它需要有供氢体和受氢体才能实现氢键结合。 4.疏水作用:
抗原抗体分子侧链上的非极性氨基酸（如亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸）在水溶液中与水分子间不形成氢键。当抗原表位与抗体结合点靠近时，相互间正、负极性消失，由于静电引力形成的亲水层也立即失去，排斥了两者之间的水分子，从而促进抗原与抗体间的相互吸引而结合。这种疏水结合力对于抗原抗体的结合是很重要的，提供的作用力最大。 抗原抗体反应的特点 特异性 可逆性 特异性
抗原抗体的特异性 是指抗原分子上的抗原决定簇和抗体分子超变区结合的特异性，由这两个分子之间空间结构的互补性决定的。 不同的抗体超变区氨基酸残基的变异性使曹沟形状千变万化，只有与其结构互补的抗原决定簇才能如楔状嵌入，所以抗原与抗体的结合具有高度的特异性。 可逆性
抗原抗体反应遵循生物大分子热动力学反应原则，其反应式为： [Ab-Ag]／[Ab]·[Ag]=k1/k2=k
式中各反应项的单位以mol表示，k1表示反应速度常数，k2为逆反应速度常数，K是反应平衡时的速度常数。由上式可知，K值是反映抗原抗体间结合能力的指示，所以抗体亲和力通常以K值表示。 抗原与抗体结合形成复合物后，在一定条件下，又可以解离为游离的抗原与抗体，这种特性称为抗原抗体反应的可逆性。 抗原抗体的结合是分子表面的非共价键结合，形成的复合物是不牢固的，在一定条件下可以解离因此抗原抗体反应形成复合物的过程是一
个动态平衡。
影响抗原抗体反应的因素 抗原抗体本身的因素： 抗原：
抗原的理化性状、表面抗原决定簇的种类和数目等均可影响抗原抗体反应的结果。 抗体：
? 来源 不同动物来源的免疫血清，其反应性存在差异。尤其是其Fc段不同，需用不同的二抗。 ? 浓度 抗体的浓度过低，抗原抗体不能结合，过高抗原抗体会发生非特异性结合，一般选取尽可能低的浓度保证抗原抗体结合的特异性。
? 特异性与亲和力 抗体应尽可能选择高特异性、高亲和力的抗体，以保证试验的可靠性。
反应环境因素： 电解质 酸碱度 反应时间 振荡和搅拌 温度
一般以15～40℃为宜，最佳反应温度为37℃，在此范围内，温度升高可加速分子运动，抗原与抗体碰撞机会增多，使反应加速。但若温度高于56℃时，可导致已结合的抗原抗体再解离，甚至变性或破坏；温度越低，结合速度越慢，但结合牢固。 共同抗原和交叉反应 两种来源不同的抗原，除各有其主要的特异性抗原决定簇外，相互之间也存在部分相同的抗原决定簇，这种共有的抗原决定簇称为共同抗原。
一种共同抗原刺激机体产生的抗体，可与其他含有共同抗原的物质发生结合反应，称为交叉反应。 对照的设置 阳性对照 阴性对照 空白对照
指不做任何实验处理的对照组。空白对照能明白地对比和衬托出实验组的变化和结果,增加说服力。 间接免疫荧光法基本原理 Western blot 原理 观察物质的转位
亚细胞结构中不同物质的共存 蛋白表达共定位 荧光蛋白：
绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）:分子量27kD，其融合蛋白不影响结合蛋白的生物学功能，转染的细胞继续传代也能观测；吸收光的波长最高峰在395nm处，在479nm处也有吸收峰，发射的绿光波长最高峰在509nm。
2008年诺贝尔化学 奖授予日本化学家下村修（Osamu Shimomura）、美国科学家马丁?沙尔菲（Martin Chalfie）和美籍华裔科学家钱永健（Roger Y. Tsien）三人，以表彰他们“发现和发展了绿色荧光蛋白质”技术 绿色荧光蛋白标记的猪 GFP主要应用:
对活细胞中的蛋白质进行准确定位及动态观察 可实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、分裂、分化过程中或外界刺激因子的作用下的时空表达, 如某种转录因子的核转位、蛋白激酶C的膜转位等。
GFP基因与分泌蛋白基因连接后转染细胞, 可动态观察 该分泌蛋白分泌到细胞外的过程
GFP基因与定位于某一细胞器特殊蛋白基因相连,就能显 示活细胞中细胞核、内质网、高尔基体、线粒体等细胞器的结构及病理过程 可用于观察分子的运动（FRAP） 蛋白之间的相互作用（FRET） 细胞内游离Ca2+测量
检测游离Ca2+ 变化荧光探针的原理：
探针多为Ca2+ 螯合剂，不与Ca2+ 结合时不发荧光，通常也不能进入细胞膜，只有与乙酰甲酯AM相连方可进入细胞内，被细胞内酯酶水解后并与胞内游离钙结合后发出荧光。 常用Ca2+测定的荧光探针
Cl–荧光探针
细胞内 Cl–浓度的测定和Cl– 通道的研究目前很活跃。
例如囊性纤维化是由于编码Cl– 转运通道的基因突变引起。通过Cl–
通透性分析可用来检测其转运通道CFTR和其他阴离子转运蛋白的活性。
大多数荧光Cl–探针是6-甲氧基喹啉衍生物。
常用的探针有6-甲氧基-N-(3-硫丙基) 喹啉(SPQ)；N-(乙氧羰甲基)-6-甲氧基喹啉溴化物[N-(Ethoxycarbonylmethyl)-6-methoxy quinolinium bromide，MQAE]；6-甲氧基-N-乙基喹啉碘化物[ 6-Methoxy-N-ethylquinolinium iodide，MEQ]；光泽精(Lucigenin) （四）膜电位
以往测定膜电位多用微电极直接插入法测量，不仅操作麻烦，需要专门仪器，费用昂贵，而且对细胞也是一种损伤。激光扫描共聚焦显微镜则可利用荧光探针在细胞膜内外分布的差异测出膜电位，不但可以观察细胞膜电位的变化结果，更重要的是可以用于连续监测膜电位的迅速变化。膜电位荧光探针根据其对膜电位变化反应速度的快慢分为快、慢两类探针，各类均有10多种。
快反应染料对膜电位的变化可在数毫秒内作出反应，适用于测量膜电位快速变化的细胞，如神经细胞、心肌细胞等。
而慢反应染料的反应速度则相对较慢(几秒或几分钟)。
DiSBAC2(3)为常用的膜电位荧光探针，为带负电荷的阴离子慢反应染料。该探针本身无荧光，当进入细胞与胞浆内的蛋白质结合后才发出荧光，测量时要求细胞浸在荧光染料中。当细胞内荧光强度增加即膜电位增加示细胞去极化；反之，细胞内荧光强度降低即膜电位降低示细胞超极化。 Rhodamine 123主要用于线粒体膜电位测量。Rhodamine123是一种亲脂性阳离子荧光探针，当线粒体膜内侧负电荷增多时，荧光强度增加，与DiBAC4(3)的表示形式相反。
JC-1 (5,5‘,6,6’-tetrachloro-1,1‘,3,3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide)是检测活细胞线粒体膜电位最合适的探针。
JC-1 在低浓度或低膜电位情况下，以单体形式存在，发绿色荧光。 较高浓度(0.1 μM以上的水溶液) 或较高电位条件下，JC-1 形成红
