荧光探针的充分溶解是很重要的。常用溶剂甲醇、乙醇、DMSO、水（生理盐水）缓冲液等。储存液中荧光探针的浓度一般为10-1000μm。 注意：
a.甲醇、乙醇低沸点、易挥发，使用时防止其挥发造成探针浓度浓缩和干燥。
b.DMSO易凝固，要在25℃以上待其充分融化以后再用于溶解荧光探针。
c.对于难溶解的荧光探针，可考虑用超声溶解。 3. 确定荧光探针标记待测样品的条件
影响胞内荧光探针浓度及分布的因素可分为两类： a.由细胞本身决定的因素，如细胞种类、活性、膜表面积结构和大小、细胞内成分和结构等。
b.染色条件，如初始的细胞外染料浓度及细胞浓度、荧光探针与细胞孵育时的时间、PH、温度、接触面积、溶剂的极性、共存物质的种类等。
4.荧光染色方法：
(1)生物样品与荧光探针（或其衍生物）直接结合，使样品具有荧光。 许多荧光探针是疏水性的，很难或不能进入细胞。可以用乙酰羟甲基酯(AM)作为载体，将探针运送入细胞。荧光探针与AM结合后变成不带电荷的亲脂性化合物，易于通过质膜进入细胞。之后细胞内的AM被非特异性酯酶水解释放出荧光探针，由于探针的疏水性使其不易透出质膜。荧光探针与细胞内的靶结构或靶分子结合，从而能有效的发挥作用。例如：Fluo-3就需要AM的辅助
(2) 显微注射法：该法复杂精细，而且得到荧光的细胞少。 例如：膜片钳导入法、微量电泳注射法、压力注射法
(3) 膜通透法增强探针跨膜能力 例如：透膜剂、低渗培养液或低pH培养液短期刺激。
(4)首先用荧光探针将某些特定的分子标记，这些特定分子再与样品作用，通过检测细胞内荧光强度和位点，达到测定细胞内靶分子的含量及其定位的目的。
例如：免疫荧光法、荧光标记的药物及蛋白的跨膜研究，尤其是间接免疫荧光法更为常用。 二、荧光样品的制备注意事项
依据试验目的选择合适的荧光探针及染色策略
例如：Hoechst33258具有透膜性能，即能够跨过活细胞膜进入细胞标记DNA，也可以标记死细胞；而PI则不具备透膜性能，只能标记死细胞的核酸。
选择合适的探针浓度，防止非特异性标记。合理设置对照，识别结果中的假阳性或假阴性。
保持样品应有的结构形态完整性。 荧光强度适宜、具有可重复性。 注意荧光稳定性
光敏效应弱：主要表现为在光的作用下，荧光探针发生荧光淬灭或增强。照射光强度越大、波长越短，则光敏现象越严重。例如：强光照射下荧光探针FITC易淬灭，而DCFH则会发生荧光增强。
环境因素：探针所在介质的温度、组成成分（pH、淬灭剂的浓度等） 样品中多重荧光之间的相互影响
光漂白性：激发光的强度超过一定限度时，光吸收趋于饱和，并不可逆地破坏激发态分子。
图像背景低、非特异性染色少
尽早上机采集图像。防止荧光探针被排出细胞、荧光淬灭及细胞干燥等导致的荧光变化。 重点内容回顾 荧光探针的用途：
1.蛋白质、单糖和多糖探针 2.细胞器探针 3.核酸探针
4.细胞活性探针 5.膜和受体探针
6.细胞膜电位和细胞内pH探针 7.金属离子探针
8.分子的特殊基团结合探针和其它 荧光样品的制备注意事项
依据试验目的选择合适的荧光探针及染色策略
例如：Hoechst33258具有透膜性能，即能够跨过活细胞膜进入细胞标记DNA，也可以标记死细胞；而PI则不具备透膜性能，只能标记死细胞的核酸。
选择合适的探针浓度，防止非特异性标记。合理设置对照，识别结果中的假阳性或假阴性。
保持样品应有的结构形态完整性。 荧光强度适宜、具有可重复性。 注意荧光稳定性
光敏效应弱：主要表现为在光的作用下，荧光探针发生荧光淬灭或增强。照射光强度越大、波长越短，则光敏现象越严重。例如：强光照射下荧光探针FITC易淬灭，而DCFH则会发生荧光增强。
环境因素：探针所在介质的温度、组成成分（pH、淬灭剂的浓度等） 样品中多重荧光之间的相互影响
光漂白性：激发光的强度超过一定限度时，光吸收趋于饱和，并不可逆地破坏激发态分子。
图像背景低、非特异性染色少
尽早上机采集图像。防止荧光探针被排出细胞、荧光淬灭及细胞干燥等导致的荧光变化。
荧光探针的用途：
1.蛋白质、单糖和多糖探针 2.细胞器探针 3.核酸探针
4.细胞活性探针 5.膜和受体探针
6.细胞膜电位和细胞内pH探针 7.金属离子探针
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荧光样品的制备注意事项
依据试验目的选择合适的荧光探针及染色策略
例如：Hoechst33258具有透膜性能，即能够跨过活细胞膜进入细胞标记DNA，也可以标记死细胞；而PI则不具备透膜性能，只能标记死细胞的核酸。
选择合适的探针浓度，防止非特异性标记。合理设置对照，识别结果中的假阳性或假阴性。
保持样品应有的结构形态完整性。
荧光强度适宜、具有可重复性。 注意荧光稳定性
光敏效应弱：主要表现为在光的作用下，荧光探针发生荧光淬灭或增强。照射光强度越大、波长越短，则光敏现象越严重。例如：强光照射下荧光探针FITC易淬灭，而DCFH则会发生荧光增强。
环境因素：探针所在介质的温度、组成成分（pH、淬灭剂的浓度等） 样品中多重荧光之间的相互影响
光漂白性：激发光的强度超过一定限度时，光吸收趋于饱和，并不可逆地破坏激发态分子。
图像背景低、非特异性染色少
尽早上机采集图像。防止荧光探针被排出细胞、荧光淬灭及细胞干燥等导致的荧光变化。
激光扫描共聚焦显微镜的应用
（一）细胞或组织内核酸的定位、定性
荧光探针分子与核酸的结合基本上有三种方式:嵌入式结合方式、结构亲和方式、以共价键方式结合
1.常用核酸染料包括花青类和经典核酸染料两大类。
1) 花青染料包括: 核酸超敏定量和凝胶染色的染料，细胞非通透性的TOTO、TO-PRO、SYTOX染料家族，细胞通透性的SYTO 染料家族，能用来形成生物交联物的化学反应性SYBR染料。
2) 经典核酸染料包括：插层染料, 如溴化乙锭和碘化丙啶(propidium iodide)PI；小沟结合剂, 如DAPI和Hoechst染料；不同性质的核酸染料，包括吖啶橙(AO)、7-AAD、LDS 751和羟基芪脒(hydroxystilbamidine), 各具有特殊性质。
图示活的牛肺动脉内皮细胞与细胞通透性的淡兰色荧光二氢乙锭和绿色荧光线粒体染料
图示DAPI与DNA结合的X-线晶体结构。X-线晶体学显示DAPI与DNA在小沟结合。
DAPI是出色的核复染剂，可显示出清楚的染色体显带图案 （二）蛋白质的定位、定性 ? 免疫荧光 直接免疫荧光 间接免疫荧光
? 绿色荧光蛋白
免疫学中抗原抗体知识回顾
常见的以免疫学为基础的分析方法 一、免疫组化 二、pull down 三、免疫共沉淀
四、酶联免疫吸附（ELISA） 五、western blot 六、激光共聚焦
七、流式细胞仪分析 等等。。。。
抗体的常见标记
单克隆抗体和多克隆抗体 单抗与多抗的区别
单抗 多抗
抗体组成 单一 复杂 抗体性质 个体的属性 群体综合的性质 纯化标记 容易，效果好 难度高一些
种属来源 绝大多数是小鼠 兔子、羊、豚鼠等 制备周期 长 (最短4个月） 短（2个月） 制备技术 复杂 简单 经费 多 少 抗原决定簇
1、概念 抗原决定簇（antigenic determinant, AD)是指抗原中决定抗原特异性的特殊化学基团，又称为表位（epitope)。表位的性质、数目和空间构象决定着抗原的特异性。抗原通过AD与相应淋巴细胞表面的抗原受体结合，激活淋巴细胞，引起免疫应答。
2、种类和数量 一个抗原分子可以有一种或多种不同的AD ，一种AD决定着一种特异性，多种AD决定着多种特异性
3、部位 位于抗原表面的AD能直接被相应淋巴细胞所识别，称功能性决定簇，存在抗原分子内部的AD无激发免疫应答的功能，称隐蔽决定簇。只有经理化因素处理后，使之暴露可能成为新的功能决定簇。 顺序决定簇和构象决定簇 顺序决定簇（线性决定簇）：
一段序列相连的氨基酸片段形成
