色素上皮细胞内的维生素A呈绿色荧光，某些神经内分泌细胞和神经纤维内的单胺类物质（儿茶酚胺、5－羟色胺、组胺等）在甲醛作用下呈不同颜色的荧光，组织内含有的奎宁、四环素等药物也呈现一定的荧光。
3 细胞内的某些成分可与荧光素结合而显荧光，如溴化乙锭与吖啶橙可与DNA综合，进行细胞内DNA含量测定。
4 荧光显微镜更广泛用于免疫细胞化学研究，即以异硫氰酸或罗丹明等荧光素标记抗体（一抗或二抗），用该标记抗体直接或间接地与细胞内的相应抗原结合，以检测该抗原的存在与分布。
用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。缺点分辨力不高 激光共焦扫描显微镜
（Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM） LSCM的基本结构、工作原理 荧光探针的选择原则
LSCM在生物医学领域中的应用 激光共聚焦扫描显微镜简介 80年代研发的新型显微镜 以荧光显微镜成象原理为基础
采用激光扫描装置，利用计算机生成图象
得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象，在亚细胞水平上观察细胞，还能显示诸如Ca2+、pH值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化。 发展史
1、20世纪50年代中期提出。
Marvin Minsky在哈佛大学博士后工作期间，提出了共聚焦显微镜的基本概念，并于1957年申请了技术专利。Minsky的发明并没有马上引起人们的注意，主要原因是没有足够强度的光源，并且当时计算机的能力还不足以处理大量的数据。 2、90年代发展成熟。
随着光学和电子技术的发展产生了更稳定和更强的激光、更高效的扫描镜片组、高效能的光纤、更精细的镀膜技术和更低噪音的检测器。更多适合激光激发的荧光染料不断被合成。相应的计算机处理器速度快速发展，图像显示技术增强和大容量的存储设备的产生，推动了激光扫描共聚焦显微镜迅速普及。
2006年购入OLYMPUSFV1000，耗资18.7万美元。
激光扫描共聚焦显微镜 结构和工作原理 目标要求
1.掌握激光扫描共聚焦显微镜技术的工作原理。 2.熟悉激光扫描共聚焦显微镜的结构。 3.了解激光产生的原理。
4.了解激光扫描共聚焦显微镜的功能。 一、基本组成
（一）激光器:多线氩离子(458 nm, 488 nm, 514 nm) 、氦氖绿(543nm)、氦氖红(633 nm) （二）扫描器(内装有针孔光栏、分光镜、发射荧光单色器及检测器)、荧光显微镜(装有微量步进马达)系统，实现点光源在样品上逐点逐层扫描成像
（三）光学装置：根据样品中荧光信号的强弱、大小及分布，调节激光能量、检测孔光栏、光电倍增管（PMT）的检测范围、物镜和电子放大倍数（zoom），以利于采集各种荧光信号。
（四）计算机图像存储与处理及控制系统：实现了图像的优化、三维重建，实现了全自动程序化控制采集（检测）样品荧光图像的时间和空间，并和同时采集样品中多重荧光信号的分解及合成图像，对其进行定量测定。
二、激光器激光产生的原理 （1） 受激吸收 激光器的结构 激光工作介质
在这种介质中可以实现粒子数反转，以制造获得激光的必要条件。 激励源
通过一定的方式使处于高能级的粒子数增加。包括电激励，光激励，热激励、化学激励等方法 。 谐振腔
光在谐振腔中来回振荡，造成连锁反应，雪崩似的获得放大，产生强烈的激光，从部分反射镜子一端输出。 三、扫描器 四维扫描模式
激光扫描共焦显微镜的发展趋势
多光子激光扫描显微镜— Multiphoton Laser Scanning Microscopy
在生物及医学成像,单分子探测,三维信息存储,微加工等领域得到广泛应用,展示了广阔的发展前景. 多光子激光扫描显微镜简介
1. 多光子激光器波长从700-1000nm连续可调 双光子波长：350-500nm 连续 三光子波长：230-330nm 连续
应用：可直接清晰活体观察某些非标记神经递质的分泌 (5-HT) 或 NADPH的分布
多光子激光扫描显微镜优点与局限: 优点:
1 对生物样品的光损伤小 2 有效观测时间长 3 穿透深度深 4 荧光收集率高
5 对探测光路的要求低 6 适合多标记复合测量 局限:
1 只能对荧光成像
2 样品可能受到热损伤.(若样品含吸收激发光的色团,如黑色素) 3 超快激光器较为昂贵
四、激光共聚焦扫描显微镜技术特点 激光光源
逐点、逐行、逐面快速扫描被激发荧光成像
共聚焦 ：扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点 五、激光共聚焦扫描显微镜技术优点
用激光做光源因为激光的单色性非常好,光源波束的波长相同,从根本上消除了色差。
采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个当中带有小孔的挡板,
将焦平面以外的杂散光挡住,消除了球差;并进一步消除了色差 采用点扫描技术将样品分解成二维或三维空间上的无数点,用十分细小的激光束(点光源)逐点逐行扫描成像,再通过微机组合成一个整体平面的或立体的像。而传统的光镜是在场光源下一次成像的,标本上每一点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。这两种图像的清晰度和精密度是无法相比的。
用计算机采集和处理光信号,并利用光电倍增管放大信号图
在共聚焦显微镜中,计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像,得到的图像是数字化的,可以在电脑中进行处理,再一次提高图像的清晰度。而且利用了光电倍增管,可以将很微弱的信号放大,灵敏度大大提高。由于综合利用了以上技术。可以说ＬＳＣＭ是显微镜制作技术、光电技术、计算机技术的完美结合,是现代技术发展的必然产物。 五、激光共聚焦扫描显微镜应用优势 半定量分析方便。 激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的定量。
分辨率高。由于激光束的波长较短，光束很细，排除焦平面以外光的干扰，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。
可重构样品的三维结构。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内，调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机重新组合，就能显示细胞样品的立体结构，给出细胞内各部分之间的定量关系及各种结构线度。 可连续摄像
六、LSCM的功能
1.获取透射光、反射光及荧光图像，能进行定性及定位分析及图像处理
2.无损伤、连续光学切片，显微“CT” 及三维重组
3.连续摄像 4.光谱扫描
激光扫描共聚焦显微镜 荧光探针的选择 学习目标
1.了解荧光产生的原理。
2.掌握荧光淬灭的概念及影响荧光淬灭的因素。 3.熟悉常用的荧光探针。
4.了解荧光样品的制备过程。 （一）荧光
一些物质原子受光照射时，能吸收入射光子的能量，使其电子从低能级向较高能级跃迁，处于这种激发态的分子不稳定，电子可通过跃迁的形式发射可见光子，放出多余的能量而返回基态，这种放出先前所吸收能量的可见光，即荧光。荧光在停止激发的时候发光在10-7-10-8s内停止。
可见：荧光是发射光。
即：物质吸收短波光，发射出的长波光。 荧光的种类：
自发荧光（固有荧光） 二次荧光
3.荧光探针的用途：
1.蛋白质、单糖和多糖探针 2.细胞器探针 3.核酸探针
4.细胞活性探针 5.膜和受体探针
6.细胞膜电位和细胞内pH探针 7.金属离子探针
8.分子的特殊基团结合探针和其它 二、荧光样品的制备过程
（一）荧光标记前样品的准备
组织标本：活的组织切片、冰冻切片和固定切片 细胞标本：爬片、穿刺液涂片、液体沉淀涂片
在保证形态完整、达到试验目的的情况下，切片厚度越薄越好，一般为4-35μm
（二）用荧光探针标记样品 1.荧光探针的储存和配制
一般按产品说明书要求，避免反复冻融。工作液现用现配。 2.正确溶解荧光探针
