4.3 microRNA 的关联性状研究
mRNA 作为编码蛋白质的唯一信使，在决定生物表型时具有重要作用，microRNA 通过修饰调节mRNA 来改变生物体的外观表型，现在研究中最常见的就是microRNA 本身发生单碱基的突变，形成的SNP 位点改变了microRNA 的序列，从而使其与mRNA 的作用发生改变，而这个SNP 可作为关联性状的标记。在一项研究中，科学家发现一个候选基因，它可能参与每窝仔猪的数量的调控，这个基因位于僵猪的一个QTL 附近。通过对大白猪和梅山猪miR-27a 基因的测序，发现一个T /C 突变的SNP 位点，然后通过对大白猪和梅山猪SNP 位点与每窝仔猪数进行关联分析，证明了梅山猪的仔猪中，AA 基因型不同于AB 和BB，并且AA 基因型仔猪的成活率也不同于AB，而在长白猪中并没有此差异。几乎在相同时间，科学家们鉴定出猪miR206 /MiR133B 的基因中有12 个SNP 位点，其中10 个与miR206 相关，两个与miR133B 相关，对不同猪种等位基因频率的测定，并且对肌纤维特点、瘦肉率、产肉质量与miR206 和miR133B 的SNP 位点进行了关联分析，发现miR206 与肌肉形成的IIa、IIb类型纤维相关，与汁液流失率、明亮度和背标厚度、瘦肉率等肉质质量相关，发现miR133B 的SNP 位点与总
肌肉纤维数目、眼肌面积和肌肉的pH 相关。这些SNP 位点显著影响miR206 和miR133B 的成熟，主要是通过调节原始microRNA 转变为microRNA 前体的过程。更有趣的是，在miR206基因型的SNP 中，改变其SNP 的量与表型变异型相关，这就说明，猪miR206 /miR133B 簇的多态性对于肌肉和肉质性状来说是一种遗传因子。成骨蛋白( BMP5) 基因是SSC7 脂肪性状数量基因座的潜在位置基因，通过对梅山猪和大白猪的比较测序，发现一个位于3'非编码区131 处C /T 的SNP 位点，通过对322 头大白猪和梅山猪杂交二代进行关联分析，发现CC 基因型比TC 基因型有更薄的背部脂肪和更重的后腿肌肉，并且与TT 基因型相比有着有更高的脂肪百分比和更少的瘦肉率。此外，C /T 碱基的改变可能通过RNA 杂交的方式使BMP5 基因与let-7c 和miR-184 发生互作。通过对猪成纤维细胞
过表达BMP5 基因发现， let-7c 和miR-184 会抑制BMP5基因的表达。这就表明这两个microRNA 可能参与BMP5 基因的翻译抑制，这个SNP 位点对于脂肪性状有着很好的标记作用。
5. microRNA在肌肉组织中的表达及调控
生肌调控因子，如肌分化因子（MyoD）、成肌素（myogenin）、肌生调控因子（MRF4）、生肌调节因子5（Myf5）、肌细胞增强因子２（MEF2）决定着肌肉的生长与发育。因此，调控这些生肌因子的microRNA影响着肌肉的增殖与分化，并与肌肉有关的疾病相联系。
研究结果表明，miR-133是通过调控血清应答因子（SRF）、肌肉增强子２（MEF2）、GATA结合蛋白4（GATA4）、Nk2转录因子5的表达，从而抑制成肌细胞分化或促进成肌细胞增殖。miR-1调控生肌因子MEF2、MyoD和其他因子的表达，增强成肌细胞的分化，抑制增殖。然而，miR-1、miR-133调节肌肉细胞的增殖和分化均是通过抑制组蛋白脱乙酰酶（HDAC4）和SRF的活性。而且miR-1抑制HDAC4的同时，HDAC4又抑制MEF2的活性。miR-206通过降低缝隙连接蛋白43的表达量，促进肌细胞融合，有利于神经肌肉接头的形成。反过来，目标因子的表达，也可诱导microRNA的表达。在肌细胞增殖、分化过程中，MyoD和成肌素的共同时序调控，诱导miR-1、miR-133和miR-206表达，其调控功能见图２。
microRNA的表达在肌肉组织和细胞中具有发育性特点。在猪胚胎发育过程中，微阵列检测肌肉组织256种microRNA的表达，发现140种microRNA的表达具有明显的发育性特点。成年猪miR-206的表达量比65胚龄猪提高2.9倍；在肌肉发育的整个过程中miR-1和miR-133的表达水平均较高。细胞水平的研究指出，miR-1和miR-133206在增殖期的卫星细胞中几乎不存在，但在胎儿生长发育的３个阶段（60、90和105ｄ）和成年时期的表达量较高，说明miR-1和miR-206调控着卫星细胞的增殖。总之，在肌肉生长发育的不同阶段，microRNA分别调控卫星细胞的增殖、分化及发育，进而影响着肌肉组织的生长。
当然，microRNA的异常调节可引起肌肉组织发育异常，出现肌肉相关疾病。研究结果表明，microRNA异常表达可引起心脏发育异常，心肌肥大和电传导等，如：miR-1和miR-133a在心律失常、心肌肥大、心肌增生的鼠中表达水平下降，miR-195在鼠和人的心肌肥大期间是上调的。因此，microRNA可作为肌肉有关疾病的诊断标记和治疗目标。因此，对microRNA调控肌肉生长发育过程的研究，不仅对microRNA的调控机制有了进一步
的认识，对动物生长发育也具有重要的影响，还能为治疗肌肉有关的疾病提供新的思路。
6. microRNA在脂肪组织中的表达及调控
microRNA调控着脂肪代谢，与脂肪代谢过程息息相关。如：miR-103、miR-122、miR-143、miR-107、miR-222等。Esau等研究结果表明，抑制小鼠miR-122的表达能减少血中胆固醇水平，促进肝脏中脂肪酸的氧化，降低肝脏脂肪酸和胆固醇的合成率。初步认为miR-122调控胆固醇和脂肪酸代谢。Xie等研究指出，前脂肪细胞miR-103和miR-143的异常表达，加速脂滴的聚集，对脂肪形成具有正调控作用。而miR-222和miR-221在脂肪形成中起负调控作用，在肥胖病人的脂肪组织中上调。在鉴定腹膜脂肪组织microRNA的研究中发现，miR-143与脂肪细胞分化有关，且促进肌内脂肪细胞的增殖；miR-103和miR-107与脂类代谢有关，miR-103在猪脂肪组织中参与脂肪代谢和脂肪细胞分化的调控；miR-221和miR-222与脂肪细胞因子的表达有关。Cho等鉴定猪肌内脂肪的生成和脂肪形成的microRNA，结果表明，在脂肪组织中检测到ssc-miR-143，且ssc-miR-143在脂肪形成分化中是上调的ssc-miR-130b、ssc-miR-338＊、ssc-miR-450b＊、ssc-miR-339在脂肪组织中均表达。进一步的功能验证显示，miR-22通过阻断TGF-β信号通路，抑制其对脂肪形成的调控。miR-143通过下调脂肪合成因子促蛋白激酶（ERK-5）基因的表达，降低脂肪组织中脂肪的合成。Let-7通过抑制脂肪酸合成因子高迁移率蛋白Ａ２（HMGA-2）基因，阻止脂肪细胞中脂类的合成。miR-27、miR-130通过直接下调脂肪细胞分化因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-γ）的表达，降低脂肪细胞的分化能力，减少脂肪细胞的数目。miR-371下调脂肪细胞分泌因子脂联素的表达，降低细胞中甘油三酯含量。反过来，目标因子也可调控microRNA的表达。在脂肪沉积过程中，TNF-α基因诱导miR-103和miR-143表达上调，而miR-221和miR-222表达下调。因此，研究脂肪组织中的microRNA对动物的脂肪沉积研究有重要的指导意义，对动物生长及品质调控分子研究具有重要的
作用。
7. miRNA靶标的动态变化与功能性靶标
每种microRNA 针对着数个甚至上百个潜在靶基因。越来越多的实验证据表明，不同的细胞或同一细胞的不同状态，某一特定miRNA可调控的靶标是不完全相同的，是动态变化的。为此，我们提出了miRNA功能靶标的概念。那么，什么原因导致miRNA靶标的时空特异性及动态变化？我们认为从以下两个方面可能得到比较合理的解释。 7.1 竞争性内源RNA 调控网络
目前认为miRNA与靶标mRNA 的比例对于miRNA的功能发挥至关重要：即如果调节本身低表达的miRNA对其靶标的影响甚微，调控高表达miRNA，将会对靶标的功能具有更深远的作用。Seitz提出竞争性内源RNA 假说，具有相同miRNA应答元件的mRNA、假基因转录物、长链非编码RNA 等转录物通过竞争性结合同种miRNA来调节各自的表达水平，从而影响生物学功能．事实上这一假说在PTEN、VACN和CD44的调控过程中得到证实．我们课题组在研究miRNA与靶标mRNA 相互作用过程中，发现了同一miRNA的不同靶标具有竞争作用，而这种竞争作用体现在mRNA 细胞质与细胞核分布比例高低，即靶标mRNA 质/ 核比例高更容易被miRNA选择调控，成为miRNA的功能靶标。在不同细胞中，或者同一细胞不同状态下，功能靶标是动态变化的，与之对应的mRNA 质核比也是动态变化的，并且具有很好的一致性。虽然mRNA 质核比的调控以及miRNA的优势选择机制都不清楚，但不妨碍将这一结果用于预测与验证miRNA在特定时空的功能靶。 7.2 靶mRNA 的单核苷酸多态性影响miRNA与靶基因的相互作用
与miRNA多态性相比，靶基因3′UTR 的多态性更加丰富。miRNA的靶基因3′端发生突变并不影响蛋白质的序列，但可以引起蛋白质表达异常．靶基因3′端突变阻碍miRNA结合，引起miRNA蛋白质合成抑制作用丧失．这种现象已在头颈部鳞状细胞癌、
