核内RNaseⅢ核酸酶Drosha等一些成分构成的微处理器（microprocessor）复合体加工成发夹结构长度约55～70nt的pre- microRNA，然后在Exportin5和Ｇ蛋白因子Ean的帮助下pre- microRNA就从核进入到了胞质内；②在细胞质内，pre- microRNA在Dicer酶与结合蛋白的作用下被切割成21nt～25nt的双链microRNA分子，然后microRNA分子被解链，其中一条降解，另一条则为成熟的单链microRNA，单链microRNA进入一个核糖蛋白复合体miRNP（也叫RNA诱导的基因沉默复合物RISC），microRNA与靶基因的3’UTR区互补配对，从而实现指导miRNP复合体对靶基因mRNA进行切割或翻译抑制。
miRNA在细胞核内DNA 聚合酶Ⅱ作用下由DNA 转录为初级miRNA（pri-miRNA），在核内经RNaseⅢ-Drosha酶加工剪切释放出发夹结构前体pre-miRNA，然后由依赖RNA 的核转运受体家族成员输出蛋白5运到胞浆，在胞浆中通过RNaseⅢDicer二次加工为单链的成熟miRNA，与RNA诱导沉默复合物（RISC）结合，识别靶mRNA并抑制其翻译，或
通过去腺苷酸化和脱帽引起mRNA降解。
miRNA的作用机制研究
动物体内发现的大多数miRNA能与目的基因mRNA 3'UTR形成不完全碱基配对，从而促进翻译抑制或靶基因mRNA 的降解；而植物体内的很多miRNA指导RISC靶向含有能与其完全互补配对序列的mRNA，这种作用通过Argonuate（AGO）核酸内切酶对靶标mRNA的强烈抑制作用完成。miRNA作用机制研究主要集中于以下几点：①miRNA可能通过抑制核糖体的组装或抑制翻译起始复合物的形成或阻止polyA结合蛋白（PABP）结合到mRNA抑制翻译起始；②miRNA可能引起新生多肽链的翻译同步降解或引发大量核糖体脱落及高频次的翻译提前终止来进行翻译起始后的抑制；③一些mRNA 降解酶通过定位于被降解的mRNA 中，介导miRNA衰减mRNA，下调靶mRNA 水平。同时，相关研究发现，miRNA在某些条件下能正调控基因的表达，miR- 10 能结合到核糖体蛋白mRNA5'UTR，促进其翻译，从而促进总蛋白的合成。然而，miRNA究竟以怎样的方式靶向目的基因调控其表达的具体机制仍不得而知。与此同时，与疾病发生过程相关的miRNA表达谱也发展成熟，但如何识别miRNA的直接靶基因成为研究的最大挑战。主要的研究方法包括计算靶标预测、实验靶标的识别及靶基因的验证。前者主要依据mRNA的靶序列与成熟miRNA 5'UTR 种子序列严格互补配对，缩小其可能的靶基因范围，但无法避免假阳性和假阴性预测的发生；后者在前者的基础上，在具体的目标细胞中使用不同的实验方法进行验证。研究发现，可以对RISC 用免疫共沉淀分离miRN-AmRNA复合物，但这种免疫共沉淀方法并不一定要求体内的miRNA-mRNA能相互作用，在细胞裂解过程中人为造成miRNA与mRNA 非特异性关联会对其产生干扰。体内的miRNA-mRNA相互作用太弱也会使免疫共沉淀失败。由于miRNA的调控能改变蛋白表达水平，蛋白质组学也可能为miRNA靶标的发现提供技术支持。氨基酸的稳定同位素标记细胞培养
（SILAC）可能是鉴定受影响蛋白的一种工具。在对靶基因进行验证时，通常使用萤光酶素报告基因系统，此时，设计合适的对照组来检测miRNA-mRNA相互作用的特异性是非常重要的，如靶基因3'UTR mRNA 序列的模拟mRNA 类似序列和突变序列都不能结合在miRNA的互补位点上。 1.6 miＲNA 的命名
miＲNA 的命名一般按照如下规则：
1) 在命名规则确定之前发现的miＲNA，如lin-4 和let-7，则保留原来名字; 2) miＲNA 的成熟体简写成miＲ，miＲNA 的前体则用mir表示，再根据其物种名称(采用3～4个字母的缩写来表示) ，以及被发现的先后顺序( 阿拉伯数字表示) ，例如mmu、hsa和rno分别代表小鼠、人和大鼠，如hsa-miＲ-124 和mmu-miＲ-124;
3) 高度同源的miＲNA在数字后加上英文小写字母( a，b，c，?) ，如hsa-miＲ-34a、hsa-miＲ-34b 和has-miＲ-34c; 4) 通常一个miＲNA 的前体长度大约为70～80nt，很可能两个臂会都会产生miＲNA。
以前的做法是: 表达水平较低的miＲNA 后面加上* 号，而表达水平较高的miＲNA 后面不加任何符号，一般认为miＲNA* 是没有功能的，但是最近有文章报道它其实是有功能的，甚至在某些组织里miＲNA* 的表达量高于miＲNA。现在已经逐渐取消了这种命名方式，如今认为，如果一个miＲNA 前体的两个臂能够分别加工产生miＲNA，则以“-5p”和“-3p”分别命名，分别表示从前体的5'端臂和3'端臂加工而来，如hsa-miＲ-124-5p 和has-miＲ-124-3p; 5) 由不同染色体上的DNA 序列转录加工而成的具有相同成熟体序列的miＲNA，则在后面加上阿拉伯数字以区别，如hsamiＲ-521-1 和hsa-miＲ-521-2。
2miRNA的鉴定方法 2.1 实验法
小RNA 分子的直接克隆测序仍然是目前鉴定miRNA的主要方法。
第一种方法是将组织RNA经变形聚丙烯凝胶电泳分离，回收19~25 nt的小分子RNA，将这些小分子RNA 的3′和5′连上接头，逆转录后用与接头对应的引物进行PCR扩增，然后将这些片段进行克隆，构建cDNA文库，并对每个克隆进行测序分析。
另一种方法为利用15%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离总RNA中16~28 nt的小片段，poly（A）聚合酶的作用在这些小片段的3′端进行多聚腺苷酸化反应，逆转录得到cDNA，并在cDNA的3′端进行多聚鸟苷酸化反应，后进行PCR扩增、克隆测序分析。 通过实验法直接进行miRNA的克隆，最大的优点是能够精确地确认每一个miRNA，并准确区分开只差一个碱基的家族分子。但是，这种方法也存在着明显的局限性：第一，文库构建时间较长，并且每个文库都需要经过大量的测序反应才能获得足够的数据，耗时、低效且价格昂贵；第二，有些miRNA具有组织特异性或在所研究的组织中可能低丰度表达，另外一些其它内源性非编码RNA和mRNA的降解产物产生的干扰，使该方法很难鉴定组织特异性或低表达的或具有特殊的碱基构成，存在转录后修饰的miRNA。
随着分子生物学技术的不断发展，大规模的测序技术不断涌现。利用高效测序技术，一个标签序列可以一次测出一段序列中的17个核苷酸序列。近年来高通量测序技术（如454，Solid和Solexa等测序平台）的出现使该方法得到了极大的完善，能够一次性获得百万级的高质量小RNA分子，并从全基因组范围内发掘已知和未知，保守和非保守的miRNA，大大的弥补了过去难于鉴定低丰度的miRNA缺点。以深度测序为基础的测序分析技术刚刚兴起，并且每次测序可获得3Gbp的序列需要，因此需要借助生物信息学的技术来处理分析。
2.2 生物信息学分析法
随着全基因组测序工作的完成，生物信息学方法逐渐发展成为鉴定miRNA的有力方法，同时，该方法弥补了直接克隆法的一些不足，大大提高了鉴定miRNA的效率。目前，
科研工作者根据已知miRNA的特征信息及其对靶分子的作用方式建立了多种miRNA的计算机识别方法。第一个预测软件是MiRscan，它能特异性的识别2个物种间的同源序列。该软件是由Lim等依据与已知miRNA相似性开发设计的。并且在线虫和人类中利用该软件共预测到了35和107个新miRNA。
利用已知miRNA的序列和结构的保守性在全基因组范围内搜索miRNA是分子生物学最常用的搜索方法，即通过对miRNA及其成熟序列的一级结构和二级结构的保守性分析寻找新的候选分子。典型的根据同源性搜索而设计的软件srnaloop是由哈佛大学医学院的Grad等利用miRNA的序列保守性及结构相似性设计而成的。该软件是一个类似于BLAST的应用程序，但是该软件支持更短片段并排列成互补的碱基对。该软件已在线虫中预测出214 种新的miRNA。另外，越来越多的研究者利用软件分析发现了新的miRNA，如Wang等开发的计算机方法MiRAlign是一种依靠序列和结构比对来寻找动物中的miRNA的方法。
当利用同源性没有发现新的miRNA时，就需要科研人员寻找其他的方法，如利用靶序列的保守性识别miRNA。在生物体内，同一miRNA可能调控多个靶分子；多个miRNA也可能作用于同一mRNA靶分子。目前，一些研究者利用靶序列中潜在的保守性作为识别miRNA的重要依据。在成熟miRNA中的种子序列（2~8位置的7个核苷酸），他们在与靶mRNA 结合中起着重要的作用。Xie等在mRNA 的3′非翻译区发现了106个保守的基本序列，其中72个与大约一半的已知miRNA5′端相结合组成6~8 bp的种子双螺旋。findMicroRNA软件是Adai等在拟南芥中利用单基因组方法设计的搜索miRNA的软件,该软件主要用于植物miRNA的鉴定。它主要依赖miRNA与其对应的靶序列紧密互补来识别候选miRNA。之后该软件将进一步对这些候选miRNA的成熟序列的相邻序列的互补性进行分析, 使得一个RNA内的茎环结构的组成和已知miRNA前体结构保持一致。拟南芥基因组中有29 399个转录本可以和27 987个特定基因座相对应, 用此软件对其分析可以在基因间隔区内识别潜在的microRNA前体序列。
