实验方法和生物信息学方法由于各有优缺点，因此，单一的方法可能不能满足试验的需要，或鉴定不出某些特异性的miRNA序列，因此，需要科研工作者同时结合这两个方法，这样在能在各种物种中准确的找到尽可能多的新的miRNA。
3miRNA的检测方法 3.1 miRNA芯片技术
基因芯片技术是近年来兴起的一种高通量、灵敏度较高的检测基因表达的方法。该方法能够在短时间内同时检测到所有已知miRNA的表达谱。miRNA表达谱的精确分析是研究miRNA在生物体中的功能及其所发挥的作用的基础。目前，有关该技术已经广泛应用于各种生物体的miRNA的表达谱分析，主要包括各种组织miRNA表达谱以及在各种生理和病理状态下的miRNA表达谱。miRNA芯片的制作中关键的步骤就是探针的设计，一般表达谱芯片采用合成的寡核苷酸或cDNA片段作为捕获探针，对转录本的高特异性和高亲和度是理想探针的目标。由于miRNA的杂交温度和成熟序列长度的限制，使得对探针的设计也受到了一定程度的限制。当利用特定的温度标记芯片的miRNA探针时，高Tm值的探针和低Tm值的探针将可能产生不平行或非特异性的信号理论上基因芯片并不能进行定量的测量，由于不同的miRNA具有不同的亲和力，但是基因芯片可以用于不同状态下miRNA表达量的比较分析。因此，通常科研人员会利用增加或减少探针的碱基长度来平衡探针的杂交温度，已获得更精确的芯片分析结果。
Liu等用含有245个人类及模式动物鼠的基因组探针的微芯片筛选miRNA，Chen Jian-Fu等通过基因芯片的方法证实了miR-1与miR-133在肌肉的发育过程中能够起到调节作用。但是，基因芯片的方法也存在着一定的不足之处，主要包括制作和检测均需要昂贵的仪器设备，而且结果的重复性比较差；对于不同的miRNA需要优化不同的杂交条件，因此对于高度相似的miRNA或同一家族中的miRNA很难区分。
最新研究结果显示，一种新的液相芯片将为后基因组时代的科学发展提供一种新的强有力的技术支持。该芯片的体系是由许多不同的小球体为主要基质所构成的，其中每个小球体上固定不同的探针分子，在每一个特定的探针上都具有一个独特的色彩编号以区分不同的探针，将这些小球体悬浮于一个液相体系中，就构成了液相芯片系统。该方法能够对同一个样品的不同分子进行快速定性，定量分析，因此这种方法也成为xMAP技术。这种精确的能够同时定性，定量的分析方法，具有非常广泛的应用前景。 3.2 RNA印迹检测方法
该方法也叫做Northern blot，广泛应用于检测分析miRNA的表达。RNA印迹通过凝胶电泳的方法将不同大小和不同分子量的总RNA进行分离，并将分离得到的RNA 转移至尼龙膜或硝酸纤维素膜上与已知标记的探针进行杂交。所得结果可同时用于miRNA的表达水平的定量检测，和用于区分miRNA前体与成熟体的位置。因此，该方法被誉之miRNA检测的“金标准”。
目前，地高辛（DIG）标记和生物素（BIOTIN）标记等一些无放射性的探针标记方法已被广泛应用。但是该方法灵敏度和特异性不高，鉴于此，科研工作者发展了用锁核酸（LNA）修饰的杂交探针取代传统的方法。渗入LNA可使探针在短时间内获得较高的Tm值，同时渗入LNA的探针与核酸序列杂交具有严格的序列特异性，在每3个碱基中渗入1个LNA，可以达到最好的杂交效果，研究表明，LNA修饰的寡核苷酸探针能够使检测的灵敏度较传统方法提高100倍以上。 3.3 原位杂交检测方法
即miRNA ISH，通过将组织或细胞中的核酸与标记的DNA或RNA核酸探针进行杂交，检测互补DNA或RNA在组织、细胞和亚细胞中位置，这种技术，就叫做原位杂交。特异性的原位杂交可以检测细胞，胚胎以及在福尔马林固定或石蜡包埋组织中miRNA的表达，该方法能更直观的展现miRNA的空间表达模式。该方法可以用来检测细胞水平的miRNA，
还可以检测和比较不同细胞系中的miRNA的表达。但是其主要缺点是技术掌握困难，所用试剂价格昂贵，试验周期长。
LNA 也同样是原位杂交技术中最常用的探针。Wienholds等首次应用LNA探针在斑马鱼中检测了数百个miRNA的空间表达模式。随着科技的发展，原位杂交的技术也得到了改进，Robert等采用RNA探针，利用TMAC的高严谨洗涤及RNaseA处理产生序列特异性的杂交条件来检测成熟的miRNA。应用LNA修饰的miRNA寡聚核苷酸探针的原位杂交目前已经成功用于斑马鱼、小鼠、鸡等物种的胚胎或组织切片研究。 3.4 荧光定量PCR检测方法
成熟的miRNA分子片段较短，常规的RT-PCR无法完成miRNA的定量或半定量检测。茎环状引物以及RNA加尾和引物延伸RT-PCR方法的发明，较好的解决了这一问题。实时定量PCR的最大优点是其检测具有较高的精度及灵敏度，不需要标记，操作简单等。利用茎环状引物所涉及的荧光定量PCR引物，能够在短时间内获得多个结果，检测多个miRNA的表达并且需要的RNA量也相对较少，因此被广泛用于组织miRNA表达谱的构建。
Stem-loop实时定量PCR是miRNA进行实时荧光定量分析的主要检测方法。该方法具有以下几个优点：特异性高，特异的茎环反转录引物能够保证定量反应不受前体的干扰，并可精确辨识高度同源的miR?NA序列；所需样品较少，需要的总RNA量仅1~10 ng左右；定量线性范围较宽和检测灵敏度较高，从几个拷贝到几万个拷贝，定量线性范围可以跨越7个数量级；适用范围广，纯化的RNA、总RNA以及细胞裂解物均可以用于检测miRNA的表达量，同时，还可以进行单细胞的miRNA表达谱分析。Varkonyi-Gasic等利用该技术成功地对拟南芥中多种miRNA进行了差异表达分析。
4 microRNA 对动物表型调控的研究进展
自从1993 年首次在线虫中发现microRNA 以来，越来越多的micoRNA相继被报道，
它们通过与靶mRNA 的特异位点结合，抑制靶蛋白的产生或者降解mRNA，从而调节内源基因表达，miRNA在基因转录组调控网络中扮演了重要的角色。 4.1 miRNA参与动物表型调控
小鼠作为分子生物学研究的模式生物，一直以来都是科学家们研究动物表型性状的良好模型。科学家们通过在肥胖小鼠的肝脏和白色脂肪组织( WAT) 中过表达miR-335，发现小鼠会发生病理性肥胖症，表明miR-335 参与了小鼠肥胖发育的调节，通过过表达miR-143 科学家发现了相同的症状，并且发现miR-143 与脂肪细胞分化marker 基因: PPAR、aP2 的表达量相关。
microRNA 对动物骨骼肌表型的调控作用主要是通过调节肌细胞的增殖与分化来实现的，为了了解microRNA 在肌肉发育中的重要作用，研究者们做了大量工作。miR-155 是一种多功能的microRNA，参与细胞增殖和分化等多种生物学功能，一些研究证明，miR-155 可促进肌肉细胞的增殖和分化。通过分析miR-155 在长白猪(瘦肉型) 和通城猪(脂肪型) 骨骼肌发育过程中的表达变化，发现在长白和通城猪骨骼肌发育过程中其呈现不同的表达模式，这就说明，miR-155能影响猪骨骼肌发育，与猪肌肉的表型有关。同样在哺乳动物中，The Olfactomedin-like 3( OLFML3) 基因对产后骨骼肌的生长发育起调控作用并随着发育下调表达，最终影响其表型，研究发现miR-155 对OLFML3 的表达也起到了调控作用。miR-148a 是一个新发现的肌源性microRNA，参与肌肉分化。过表达miR-148a，促进肌细胞分化，敲低miR-148a，抑制了肌肉分化。通过生物信息学分析，发现了ROCK1 ( rhoassociated coiled-coil containing protein kinase 1) 基因，它对肌细胞生成起抑制作用，进一步的研究发现miR-148a 作用于ROCK1 的3' UTR 区，miR-148a通过与靶基因结合并对其进行降解，解除掉了ROCK1 对肌肉生长的抑制作用，从而促进肌肉分化。miR-1、miR-206、miR-181 以及miR-29也都是通过促进肌细胞分化的形式影响骨骼肌表型的。
4.2 microRNA 敲除对动物表型的影响
科学家们发现，在小鼠中敲除Dicer、Dgcr8基因，会导致成熟的miRNA无法合成，从而小鼠在胚胎早期死于严重的发育缺陷。进一步的研究发现Dicer、Dgcr8、Drosha、Ago2 都参与成熟miRNA的合成，是小鼠生存的必需因子，同时，Dicer 以及miRNA也是形成动物皮肤、脊椎肋骨、肺脏的上皮细胞所必需的关键因子。在家猪的卵母细胞和胚胎中也发现Dicer 酶和miRNA表达，与dicer 酶特异的miRNA比如像miR-24 的表达量随着胚胎发育的不同时期和培养条件在不断变化，这种与dicer 特异的miRNA可以作为评判胚胎质量的标记基因。miR-8是参与调控果蝇体型的microRNA，miR-200s 是从果蝇延伸到哺乳动物研究中的。miR-200 家族有5 个成员: miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429。通过制备基因敲除小鼠，并与转基因小鼠杂交，获得了在脂肪细胞中剔除目的基因的小鼠，对小鼠的生长发育、生理生化和代谢指标及组织形态等多个方面进行表型分析，发现剔除目的基因簇的小鼠无胚胎致死性，并且在4 周龄的时候开始出现生长减缓的现象，体内沉积脂肪量较对照小鼠减少了一半。用生物信息学软件进一步对miR-200 靶基因和互作关系做出预测，结果发现PI3K-Akt-mT0R 等生长发育和脂肪代谢的相关信号通路被抑制是导致基因剔除小鼠山现体重减轻、脂肪减少的主要原因。在果蝇中与miR-200 功能相似的是miR-8，通过对胰岛素信号通路研究发现，果蝇的保守性microRNA miR-8 /miR-200 作用于靶基因USH/FOG2，再通过USH/FOG2 抑制PI3K 的活性来抑制细胞的生长，从而使果蝇的体型发生改变。在2012 年，科学家又发现miR-8 通过调节果蝇发育的成熟度也可以改变其体尺的大小39。miR-1 在肌肉组织中特异表达，对苍蝇敲除miR-1，会造成苍蝇在胚胎发育期死亡，或者在幼虫时期肌肉分化异常。尽管在哺乳动物中，miR-1 存在miR-1-1 和miR-1-2 两种形式，在小鼠中仅仅对miR-1-2 进行敲除，就有50% 的胚胎死于心肌缺陷，这种功能性单倍剂量不足表明miR-1是心肌发育所必需的。
