四、方法步骤 （一）接种前的准备
1．按照培养材料的需要配制培养基（实训五、六）。 2．对无菌接种间进行熏蒸或喷雾灭菌。
3．将接种需要的消毒剂、接种用具、乙醇灯、烧杯、无菌水、无菌培养皿、废液缸、培养基等臵于超净工作台的接种台面；打开超净台的电源开关，打开鼓风开关（调节送风量），并打开紫外灯消毒20min，之后关掉紫外灯，继续送风5～10min，打开荧光灯开关，准备接种。
4．用水和肥皂洗净双手，穿上灭菌过的专用实验服、帽子与鞋子，进入无菌操作室。 5．无菌操作前，将双手用乙醇棉球擦拭消毒；解剖刀、剪刀、镊子等金属工具浸蘸95%乙醇，用乙醇灯外焰灼烧灭菌，后臵于支架上冷却备用；操作过程中尽量减少无菌三角瓶和培养皿在空气中的暴露时间；所有无菌操作尽量在燃着的乙醇灯附近进行。
（二）外植体的灭菌与接种
1．选取无病虫害的嫩枝，用清水漂洗后，在接种台上进行消毒处理。用蘸有70%乙醇的棉球擦手，擦试接种台面及四周。将嫩枝放入灭菌用的小烧杯中，先用少量75%乙醇（浸没材料即可）浸泡10～30s，用过的乙醇回收后可重复使用2～3次，用无菌水冲洗1次后废液倒入废液缸中；再用2%NaClO溶液（浸没嫩枝即可）浸泡20～30min，用无菌水冲洗3～4次后废液倒入废液缸中。
2．用无菌滤纸吸干材料上的水分，臵于无菌培养皿中的无菌滤纸上，用镊子固定材料，用解剖刀切取嫩叶（0.5cm×0.5cm）、茎段（0.5cm）或芽等。
3．接种操作
（1）将接种工具插入95%乙醇中，再取出放在乙醇灯上灼烧灭菌，冷却后使用。 （2）用酒精棉球将装培养基的三角瓶从上至下擦拭消毒。
（3）取掉盛有培养基而未接种的三角瓶上的封口纸，左手握培养瓶，并将瓶口斜对乙醇灯火焰。
（4）用无菌镊子将外植体夹入培养瓶内，材料的放臵应注意极性。接种时，瓶口要在火焰附近，瓶身倾斜，以免病菌落入瓶内。
（5）接种后立即封口，写好标记。
（6）清理台面，弃去废物，并用70%乙醇擦拭台面。
4．接种后的培养基臵于25℃、2000Lx光照下培养，1～2周后，可观察有无污染的出现，4周后可以观察到愈伤组织的形成。
五、结果记录与分析
1．外植体灭菌接种时，应注意哪些事项？ 2．实训操作中出现了哪些问题？并加以分析。
实验八 植物离体培养物的形态观察
一、目的要求
识别各种外植体在离体培养条件下，形态变化和器官发生方式，同时学习观察、记录和统计的方法。
二、基本原理
通过外观形态和实体解剖镜下的观察，可以从形状、颜色、器官发生、愈伤组织的形成、是否污染、褐变、死亡等来分析和判断离体培养物的生长与分化情况。
三、材料、试剂与主要仪器
1．仪器用具 实体解剖镜、普通光学显微镜、刀片、镊子、解剖针、载玻片、盖玻片、滤纸、6cm培养皿等。
2．试剂 1mol/L HCl、1% 醋酸-洋红、45% 醋酸等。
3．材料 外植体经离体培养而形成的不定芽、不定根、愈伤组织、胚状体等。 四、操作步骤
1.观察各种外植体的接种和生长状况，统计褐变率、污染率、成活率等； 2.描述外植体以及培养物的大小、形态、颜色的变化；
3.识别愈伤组织、不定根、不定芽、丛生芽或胚状体的形态，并统计诱导率或分化率。 五、结果与分析
1．将统计结果按照下表进行记录并分析。
表5-1 培养材料褐变、污染的检验结果
外植体 种 类
接种外 植体数
褐变外
褐变率%
植体数
体数 污染外植
污染率%
植体数 死亡外
死亡率%
1 2 3
实验九 植物离体培养物的继代培养操作技术
一、目的要求
通过在超净工作台上进行无菌操作训练，掌握组织培养的继代操作技术。
二、基本原理
植物组织培养中，培养物（细胞、愈伤组织、器官、试管苗等）培养一段时间后，为了防止培养的细胞团老化，或培养基养分利用完而造成营养不良及代谢物过多积累而引起毒害等的影响，要及时将其接种到新鲜培养基中，进行继代培养。 继代培养主要分为固体培养与液体培养两种方式。固体培养可使用在组织培养过程中的各个阶段，如愈伤组织的增殖、器官的分化及完整植株的再生等阶段，液体培养主要用于植物材料再生培养的诱导前期，如愈伤组织的增殖、分化等。本实验以非洲紫罗兰、长寿花固体培养为例，学习继代培养的操作技术。
三、材料与用具
1．仪器用具 超净工作台、70％的乙醇、95％的乙醇、盛有培养基的培养瓶、接种器械（主要指解剖刀、镊子等）、乙醇灯、培养材料、无菌纸。
2．材料 非洲紫罗兰、长寿花的试管苗或愈伤组织。 四、方法步骤
1．准备继代培养的培养基MS+6-BA2 mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖3%+琼脂0.7%，pH5.8，用于诱导试管苗的增殖。
继代培养所使用的培养容器也依材料而定，一般宜选择较大的容器。
2．将接种用具、乙醇灯、烧杯、无菌培养皿、培养基等臵于超净工作台的接种台面；打开超净台的电源开关，打开鼓风开关（调节送风量），并打开紫外灯消毒20min，之后关掉紫外灯，继续送风5～10min，打开荧光灯开关，准备接种。
4．用水和肥皂洗净双手，穿上灭菌过的专用实验服与鞋子、戴上口罩与帽子，进入无菌操作室。
5．无菌操作前，将双手用70%乙醇棉球擦拭消毒，并用乙醇棉球擦拭超净工作台的台面及四壁，解剖刀、剪刀、镊子等金属工具在用乙醇棉球擦拭后，浸蘸95%乙醇，用乙醇灯外焰灼烧灭菌，后臵于支架上冷却备用。
6．培养基瓶用乙醇棉球擦拭，码放在左侧。
7．无菌纸臵于超净工作台，打开包纸，用镊子将无菌滤纸取出，臵于操作人员的正前处。
8．在乙醇灯火焰处打开外植体材料瓶，将植物材料用灭过菌的镊子取出臵于无滤菌纸上。
9．一手持镊子，一手持解剖刀，将植物材料按照要求切割。切割时，需将变褐的部位、根切下弃去。根据其增殖方式，将小苗切成单株、或小苗丛，或小段（每段均有芽）接种于继代培养基中，与初代培养不同的是，继代培养时，每瓶中的接种材料可适当多接，可材料要均匀分布。
10．在标签上写上植物编号（即原培养瓶上的编号，若没有编号可不写），日期、班级、学号，全部接完后，一起取出，放于培养架等处培养。
11．接种结束后，关闭和清理超净工作台，并清洗用过的玻璃器皿等。 五、结果与分析
1．接种过程中，应注意哪些方面？如何降低接种污染率？ 2．继代培养接种时，应如何分割培养的材料？应注意哪些问题？ 3．接种后2周，观察结果，统计污染率。
实验十 植物离体培养物的生根培养操作技术
一、目的要求
通过在超净工作台上进行无菌操作训练，掌握试管苗生根操作技术。 二、基本原理
试管苗增殖阶段，使用较多的细胞分裂素，试管苗无根或有根，但根无功能，因此，要将增殖的嫩枝进行壮苗和生根培养。一般矿质元素较低时有利于生根，所以生根培养时一般选用无机盐浓度较低的培养基作为基本培养基。用无机盐浓度较高的培养基时，应稀释一定的倍数。如MS 培养基，在生根、壮苗时，多采用1/2MS 或1/4 MS 。一般生根培养基中要完全去除或仅用很低的细胞分裂素。并加入适量的生长素，最常用的是NAA 。一部分植物由于生长的嫩枝本身含有丰富的生长素，因此也可以在无生长素的培养基上生根。本实验以长寿花、非洲紫罗兰为例，学习生根培养的操作技术。
三、材料与用具
1．设备与用具 超净工作台、70％的乙醇、95％的乙醇、盛有培养基的培养瓶、接种器械（主要指解剖刀、镊子等）、乙醇灯、无菌纸。
2．材料 非洲紫罗兰、长寿花的试管苗。
四、方法步骤
1．准备生根培养基，培养基为1/2MS+NAA 0.05mg/L+蔗糖3%+琼脂0.7%，pH5.8。 生根培养所使用的培养容器也依材料而定，一般宜选择较大的容器，而且瓶口宜大，易于将试管苗从瓶中取出。
2．将接种需用的消毒剂、接种用具、乙醇灯、烧杯、无菌水、无菌培养皿、培养基等臵于超净工作台的接种台面；打开超净台的电源开关，打开鼓风开关（调节送风量），并打开紫外灯消毒20min，之后关掉紫外灯，继续送风5～10min，打开荧光灯开关，准备接种。
4．用水和肥皂洗净双手，穿上灭菌过的专用实验服、帽子与鞋子，进入无菌操作室。 5．无菌操作前，将双手用乙醇棉球擦拭消毒，并用乙醇棉球擦拭超净工作台的台面。解剖刀、剪刀、镊子等金属工具用乙醇棉球擦拭后，浸蘸95%乙醇，用乙醇灯外焰灼烧灭菌，后臵于支架上冷却备用；
6．培养基瓶用乙醇棉球擦拭，臵于超净工作台，码放在左侧（或右侧）。
7．无菌纸臵于超净工作台，打开包纸，用镊子将无菌纸取出，臵于操作人员的正前方。 8．在乙醇灯火焰处打开外植体材料瓶，将植物材料用无菌的镊子取出臵于无菌纸上。 9．一手持镊子，一手持解剖刀，将植物材料按照要求切割。切割时，应尽可能使单株上的茎、叶保持完整，切去原来的变褐根，仅留色白、幼嫩的根。依照形态学上端向上，形态学下端向下的原则，将材料接种于生根培养基中，每瓶可适当多接材料，分布要均匀。同时宜将大小较一致的材料接种于一瓶中，以便移栽时，每瓶中材料大小一致。
10．将接好的培养瓶暂时放在超净工作台上，材料接完后一块取出培养瓶。在标签上写上植物编号（即原培养瓶上的编号，若没有编号可不写），日期、班级、学号，贴在培养瓶上。
11．接种结束后，关闭和清理超净工作台，并清洗用过的玻璃器皿等。 五、结果与分析
1．接种过程中，应注意哪些方面？如何降低接种污染率？ 2．接种后2周，统计污染率。
3．生根培养时，材料的分割与接种应注意哪些方面？
实验十一 试管苗的驯化、移栽和管理
