2.2 洗脱条件的研究样品上柱后依次用水，30%，53%，70%，90%乙醇水溶液适量进行洗脱，流量为8 ml/min。
2.3 树脂的再生用80%乙醇2 000 ml洗柱至变白色，再用4 000 ml水洗至无乙醇味，分离柱即可重复使用。
2.4 长春花中总生物碱的提取和文多灵的含量测定同时采集两种长春花，将采集的样品经50℃烘干、粉碎、过60目筛后备用。取等量长春花样品，用80%的甲醇浸泡，超声提取3次，30min/次，合并滤液，减压浓缩，加适量水稀释后过滤。进行DM-5大孔树脂吸附，然后用30%，53%，70%，90%乙醇水梯度洗脱。各流份分别减压蒸干，称重，用色谱纯甲醇溶解定容。离心，取上清、微量移液枪取10 μl 定容至1 ml。文多灵标准品配制成0.45 mg/ml，以上样品均用0.45 μm微孔滤膜过滤后备用。
2.5 色谱条件[9] 色谱柱：Kromasil ODS C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm) 流动相为水：二乙胺=986∶14，用磷酸调pH=7.2(溶液B);甲醇∶乙腈=4∶1(溶液A)，380ml B+620ml A作为流动相，检测波长：262 nm，流速： 1 ml/min;进样量为10 μl。
3 结果
3.1 DM-5大孔树脂对长春花中的文多灵的富集通过将不同洗脱条件获得的样品与文多灵标准品进行TLC对照分析和HPLC检测，发现自海南三亚和文昌引种到海口的长春花中的文多灵均富集在只有70%乙醇水洗脱液中，文多灵的回收率分别为86.5%，89.2%。见图1～3。目前，生产长春花生物碱的方法主要采用多次含氯溶剂萃取、硅胶或氧化铝柱色谱、多次结晶等过程，工艺复杂。萃取溶剂、柱色谱洗脱液因含氯，结晶溶剂使用甲醇，造成环境污染严重;而长春花类生物碱与硅胶、氧化铝填料间键合力强, 即使长时间洗脱，生物碱也不能完全洗出，而且该填料很难再生利用[8];已有较多研究表明[10，11]，大孔吸附树脂对生物碱具有良好的吸附性能。大孔吸附树脂是一种吸附性与筛选性原理相结合的分离材料，具有吸附容量大、再生简单、效果可靠，能耗低，收率高及兼具浓缩能力等优点。尤其适用于黄酮类、皂苷类、生物碱类等成分的提取分离及大规模生产[12，13]。本试验选用的DM-5型大孔树脂，是一种专用于生物碱的非极性大孔树脂，本研究发现能较好的富集长春花中的文多灵。
3.2 利用HPLC测定文多灵的含量
3.2.1 标准曲线的制备配制标准品溶液，文多灵标准品配制成0.45 mg/ ml按2，4，6，8，10 μl进样。以进样量为横坐标，峰积分面积为纵坐标进行回归分析，制得标准曲线： Y=15.096X(R2=0.999 8)。
3.2.2 加样回收率测定取已知含量的同一长春花样品3份，分别加入精确称量的0.3 mg标准品，按前面的方法提取和测定，其加样回收率为93.4%。
3.2.3 精密度和稳定性检验 取同一标准品溶液，连续进样5次，根据峰面积值计算RSD值(n=5)为0.96%，2 d内间隔进样，计算RSD值(n=5)为2.35%，结果表明样品在2 d内稳定。
2.3.4 重复性实验取同一样品按相同的提取分离和测定方法，进行3次重复性实验，测得自海南文昌、三亚引种到海口的长春花及其7%乙醇洗脱物中文多灵的含量。见表1。表1 利用HPLC测定不同样品中文多灵的含量
4 讨论
据报道，文多灵在长春花中的含量很低，一般在万分之几到千分之几之间，不同产地的长春花中含量也不相同[7]。在长春花育种上，筛选和培育高文多灵含量的品种也是一个重要育种目标。根据张琳等[8]对不同长春花系列品种包括我国海南产长春花品种以及太平洋系列、地中海系列等23个品种中文多灵含量进行测定，结果表明购自海南文昌的长春花种子在种植后的8月份盛花期叶中的文多灵含量高达0.23%，为测试品种中最高。本研究发现自海南文昌引种到海口的长春花在3月份地上部分中文多灵含量明显比自三亚引种到海口的长春花中文多灵含量高。这一结果与文献报道基本一致，但含量较低，原因可能在于采集时间和采集部位的不同。本研究可以初步得出自海南文昌引种的长春花品种具有广泛的应用价值，该富集工艺具有较好的工业化前景。
