siRNA对胃腺癌细胞株SGC-7901血管内皮生长因子基因表达的作用(2)

　　1.2 siRNA的制备 从GenBank中获取已知的人VEGF mRNA序列（ACCESSION:AB021221）。依据Promega公司提供的设计软件和试剂盒设计合成siRNA序列，见表1。 
　　表1 设计合成的siRNA序列（略）
　　1.3 细胞培养 SGC-7901细胞用含体积分数0.10新生牛血清的RPMI 1640培养基，于37 ℃、体积分数为0.05 CO2 条件下培养。
　　1.4 MTT法检测细胞抑制率 取对数生长期的SGC-7901细胞，配制6×107 /L浓度的细胞悬液，加到96孔板内（Corning，美国），每孔加100 μL。设空白对照组、脂质体组、错义序列组（错义序列组SCR序列与siRNA2 序列有相同的GC组成，但是和人的 mRNA没有明显的同源性，以此作为阴性对照［8］）、siRNA各剂量组，每组5孔，接种24 h后弃去上清，采用脂质体包裹的方式转染siRNA。siRNA1 和siRNA2 两组分别设立4个浓度，分别为100、200、400、1 000 nmol/L，分别定义为低、中、高、极高剂量组;siRNASCR组只设 200 nmol/L ，加含各浓度的siRNA Opti-MEM培养基 100 μL ;脂质体组只加脂质体，空白对照组只加Opti-MEM培养基100 μL，置于37 ℃、含体积分数 0.05 CO2、无血清培养基中继续培养6 h，每孔补加新生牛血清10 μL，继续培养。脂质体组Lipo-fectamineTM2000用量为每孔0.5 L，按Lipo-fectamineTM2000使用说明书操作。于24 h后分别加入MTT 10 μL，振荡15 min，酶标仪读出吸光度（ A ）值。计算细胞抑制率。
　　1.5 流式细胞仪观察转染siRNA后细胞的凋亡 各组细胞以1.5×105 /L密度接种于25 cm2 培养瓶，以1.4方法转染后继续培养48 h，胰酶消化离心收集并悬于PBS中，4 ℃、体积分数0.70的乙醇固定30 min，用含RNase及碘化丙锭（PI）的染色液染色30 min。应用流式细胞仪（EPICS-ELITE- ESP）进行细胞周期分析，每个样本约检测 11 000个细胞，计算各期细胞数占细胞总数的百分率。
　　1.6 RT-PCR检测转染细胞VEGF mRNA表达水平 各组细胞以1.0×105 /L密度接种于6孔板， 24 h后 弃去上清，加入siRNA1 、siRNA2 、siRNASCR200 nmol/L，按1.4方法转染24 h后胰酶消化，离心收集。TRIzol提取各组细胞总RNA，取1 g总RNA进行RT-PCR扩增。VEGF引物:上游引物:5′-TCCGGGCCTCCGAAACC-3′，下游引物:5′-CCTGGTGAGATCTGG-3′，扩增产物为421 bp;内参照GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）引物:上游:5′-ACTGCCACCCAGAAGACT-3′，下游:5′-GCT-CAGTGTAGCCCAGGAT-3′，扩增产物为292 bp。将PCR扩增产物在20 g/L的琼脂糖凝胶上进行电泳观察并照相，然后应用天能分析软件对条带进行扫描，检测各组VEGF mRNA与其对应的内参 GAPDH mRNA RT-PCR产物的吸光度（ A ）值，计算 AVEGF/ AGAPDH的比值。
　　1.7 VEGF蛋白分泌量分析 收取转染24 h后细胞上清用于检测VEGF蛋白分泌量。严格按试剂盒说明操作，将不同浓度的VEGF标准品（7.8、15.6、31.2、62.5、125.0、250.0、500.0、1 000.0 ng/L）以及不同组细胞上清液于Rayto 2100C酶标仪中检测450 nm吸光度（ A ）值。读板后仪器自动绘制标准曲线并计算出各待测样本的VEGF含量。
　　2 结果
　　2.1siRNA对SGC-7901细胞生长的抑制 siRNA1 、siRNA2 的低、中、高剂量组的吸光度值与空白对照组比较，差异均有极显著意义（ F= 12.264 ，q=9.827～10.260，P <0.01）;极高剂量组的吸光度值与脂质体组比较差异有显著意义（ q= 7.231 ，P <0.05）。错义序列组、脂质体组与正常对照组比较差异无显著性（ P >0.05）。不同剂量各组之间比较，中剂量组吸光度值最低，抑制率最高（ q= 10.198～ 10.260，P <0.001）。见表2。
　　2.2 细胞转染siRNA后对细胞周期的影响与空白对照组比较，siRNA作用的细胞G0 /G1 期（细胞静止期和DNA合成前期）比例升高，S期（DNA合成期）比例降低;错义序列组、脂质体组与空白对照组比较无明显差异。见表3。