88Arg IL-2的克隆构建及原核表达(3)

　　M为DL 2 000 Marker;①为IL-2基因;②为P5/P4片段;③为P3/P6片段;④为88Arg IL-2基因克隆插入T-A载体后PCR鉴定结果;⑤为pGEX4T-2/88Arg IL-2重组表达载体EcoRⅠ、SalⅠ双酶切鉴定
　　图2 SDS-PAGE电泳结果 （略）
　　①为DH5α诱导前;②为pGEX4T-2-DH5α诱导前;③为重组质粒-DH5α诱导前;④为DH5α诱导后;⑤为pGEX4T-2-DH5α诱导后;⑥为重组质粒-DH5α诱导后
　　图3 融合蛋白纯化的结果 （略）
　　M为蛋白Marker;①为重组质粒-DH5α诱导前;②为重组质粒-DH5α诱导后;③为纯化的融合蛋白
　　图4 Western blot鉴定结果 （略）
　　M为蛋白Marker;①为诱导细菌总蛋白的印迹;②为纯化融合蛋白印迹 
　　表1 不同稀释度88Arg IL-2的吸光度（略）
　　
　　3 讨论 
　　IL-2是20世纪90年代获准上市的重组基因工程药物。在自然状态下，IL-2具有免疫活性，可以刺激机体的CTL细胞和NK细胞产生干扰素，这种 内源性的干扰素可以使单核-巨噬细胞发生活化，产生TNF-α，导致肿瘤细胞的程序性死亡。IL-2对于其靶受体的选择性不高，在与中度亲和力受体结合后，会导致NK细胞的过度活化，从而产生过量TNF-α，杀伤正常细胞。近年来，国内外将研究热点放在对IL-2进行基因变构上，以期获得高活性和高特异性的突变IL-2替代品。JU等［4］通过定位诱变得到50多种不同的突变体，分析它们的活性后证实在IL-2分子中有3段序列对维持其活性是必需的:①N端第1～20位氨基酸;②C端第123～133位氨基酸;③58位和105位Cys。N端、C端及中央的30～60位氨基酸组成了IL-2与其受体的结合部位，这些部位的氨基酸突变均可影响其受体的识别。ARAKAWA等［5］将IL-2分子中第125位的Cys突变成Ala或Ser，转化至大肠杆菌后产生的IL-2具有与天然IL-2分子相同或更高的活性，而且生产方便。目前国外125Ser-IL-2已经FDA批准生产，125Ala-IL-2也已批准临床试用。但这些点突变未能明显改善与受体特异性结合的问题。ARMEN等［6］研究发现，在基因水平对IL-2进行特定位点的定位诱变，将编码几个特定位点的酸性氨基酸变为碱性氨基酸，可以显著改变与IL-2受体α、β、γ链结合的亲和力，从而增强变构IL-2与机体抗肿瘤免疫的主要细胞―― ―CTL细胞的活化，而减弱非特异性的NK细胞杀伤作用。本实验室构建了变构IL-2（88Arg IL-2）的基因克隆，并在原核表达系统中高效表达了该蛋白的融合蛋白且获得了纯化的融合蛋白。该88Arg IL-2与目前市售IL-2单克隆抗体可发生特异性抗原抗体反应，提示该点突变对IL-2的抗原性没有影响。在此基础上，利用MTT比色法检测了 88Arg IL-2促进IL-2依赖CTLL-2细胞株生长的作用，结果显示，88Arg IL-2与天然IL-2有相近的生物学活性。但在本研究中，未能获得HPLC纯的非融合88Arg IL-2，暂时不便比较 88Arg IL-2与天然IL-2的活性高低。这将在今后的研究工作中进一步补充完善，并将探索比较其在激活CTL细胞、NK细胞、LAK细胞等方面的作用优势。
　　［参考文献］
　　［1］ HENNEY C S， GALLO K. Interleukin-2 augments natural killer cell activity［J］. Nature， 1981，291:335.
　　［2］ 孙卫民，王惠琴. 细胞因子研究方法学［M］. 北京:人民卫生出版社， 1999: 387-408. 
　　［3］ GILLIS S， SMITH K A. Long term culture of tumor-specific cytotoxic T cells［J］. Nature， 1977， 268:154.
　　［4］ JU G， COLLINS L， KAFFKA K L， et al. Structure-function analysis of human interleukin-2［J］. J Bio Chem， 1987，262:5723.
　　［5］ ARAKAWA T， BOONE T， DAVIS M. et al. Structure of unfolded and refolded recombinant derived ［Ala 125］ interleu-kin 2 ［J］. Biochemistry， 1986，25:8274.
　　［6］ ARMEN B， HANAFELT S. A T-cell-selective interleukin-2 mutein exhibits potent antitumor activity and is well tolerated in vivo［J］. Nature Bio， 2000，16:1197.