88Arg IL-2的克隆构建及原核表达(2)

　　1.2.2pGEX4T-2/88Arg IL-2重组表达克隆构建和鉴定 根据88Arg IL-2基因序列，设计合成2条引物，IL-2上游引物:5′-GTCAGAATTCCCGCAC-CTACTTCAAGTTCGACA-3′，IL-2下游引物:5′-CACTGTCGACTCAAGTTAGTGTTGAGATG-ATG-3′。其中在IL-2上游引物的5′端引入EcoR Ⅰ的酶切位点和4个保护碱基，IL-2下游引物的5′端引入终止密码子、Sal Ⅰ的酶切位点和4个保护碱基。PCR产物应用Promega公司Wizard DNA Clean-up纯化后用EcoR Ⅰ和SalⅠ进行双酶切后回收，同时对表达载体pGEX4T-2也用上述酶进行双酶切后回收，用T4 Ligase将两者连接后，转化至E.coli DH5α中构建pGEX4T-2/88Arg IL-2重组 表达 克隆，再对重组载体进行EcoR Ⅰ 和Sal Ⅰ 酶切鉴定。 
　　1.2.388Arg IL-2融合蛋白的表达和纯化 挑取含pGEX4T-2/88Arg IL-2重组质粒的E.coli DH5α接种于LB培养液中（含100 mg/L氨苄青霉素），在37 ℃下振荡培养至 A600约为0.6。加诱导剂IPTG至终浓度1 mmol/L，37 ℃继续培养4 h。收集菌液，将菌斑超声裂解。离心分离上清和沉淀，分别在 120 g/L SDS-PAGE凝胶中电泳。将电泳后的凝胶用考马斯亮蓝染液染色，观察表达情况。另按上述方法经超声裂解细菌，收获大量上清液，加入GST Fusion Protein Purification bead振荡30 min浓缩纯化，以得到纯化的pGEX4T-2/88Arg IL-2蛋白。 
　　1.2.488Arg IL-2融合蛋白的Western blot鉴定 将电泳后的含表达 蛋白和标准相对分子质量蛋白Marker的凝胶用电转仪（BIO-RAD公司产品）转至PVDF膜上。电转结束后，切下Marker膜条，用丽春红染液染色备用。余下的膜条，用IL-2单克隆抗体（一抗）和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG（二抗）在转移后的PVDF膜上行酶免疫固定检测88Arg IL-2的抗原性。 
　　1.2.5MT T比色法检测88Arg IL-2生物学活性 用含体积 分数0.1胎牛血清的RPMI 1640液体调整CTLL-2细胞浓度为（3～5）×108 /L，96孔板中每孔加100 μL，将纯化后的变构IL-2定量到5 g/L，然后以此为原液进行倍比稀释，设7个稀释度， 每个稀释度做3个复孔，同时设阳性对照孔（每 100 μL中 加入10 U rhIL-2标准品）、空白对照（加入培养液），37 ℃ CO2 培养24～48 h，待空白对照孔细胞95%死亡时，加入MTT 20 μL（50 g/L），继续培养 4 h后 ，每孔再加入二甲基亚砜（DMSO） 200 μL终 止反应，微量振荡器振荡10 min，在酶标仪上检测 570 nm 波长处各孔吸光度（ A ）。
　　2 结果
　　2.188Arg IL-2基因PCR产物鉴定及序列测定88Arg IL-2的PCR产物为472 bp（图1）。基因测序结果进一步证实，插入的基因序列完全正确，并保证了插入基因的正确阅读。
　　2.2pGEX4T-2/88Arg IL-2重组表达载体的酶切鉴定 pGEX4T-2/88Arg IL-2重组质粒经PCR鉴定、EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切鉴定后获得了大小相符的片段（图1）。
　　2.3重组质粒pGEX4T-2/88Arg IL-2在E.coli DH5α中的表达和初步纯化 将含pGEX4T-2/88Arg IL-2重组体的E.coli DH5α经IPTG诱导，并用超声粉碎处理菌体后进行SDS-PAGE电泳，同时设空菌、空质粒对照。结果在相对分子质量为42 000位置有明显的融合蛋白表达条带，并确认表达的融合蛋白大部分以包涵体的形式存在于菌体中（见图2）。经GST Fusion Protein Purification bead纯化后的融合蛋白电泳条带见图3。
　　2.4 Western blot鉴定 Western blot检测结果表明，在相对分子质量为 42 000处 ，未经纯化的融合蛋白和纯化的融合蛋白均有一特异的棕色条带（图4），证明 88Arg IL-2融合蛋白与市售IL-2单克隆抗体发生特异性反应， 说明纯化的88Arg IL-2融合蛋白保持天然的抗原性。

　　2.5MTT比色法检测88Arg IL-2的生物学活性88Arg IL-2与市售rhIL-2标准品都有维持CTLL-2生长的活性。见表1。
　　
　　图1 88Arg IL-2基因PCR产物及pGEX4T-2/88Arg IL-2重组质粒的酶切鉴定（略）