作者：孟林 刘明军 王斌 钱冬萌
【关键词】 白细胞介素2;基因突变;原核表达;蛋白质印迹法;MTT比色法
［摘要］目的 构建88Arg IL-2的重组克隆，并在大肠杆菌中表达。方法 根据天然IL-2的基因序列设计含目的突变位点的引物，经PCR定点诱变技术获得 88Arg IL-2的重组克隆，插入原核表达质粒pGEX4T-2中，经IPTG诱导在大肠杆菌DH5α中表达88Arg IL-2与GST的融合蛋白。结果所表达的蛋白相对分子质量约为 42 000 。Western blot检测结果表明，该蛋白具有与亲本IL-2相同的抗原性。MTT比色结果表明，88Arg IL-2可促使IL-2依赖细胞株CTLL-2生长，具有与亲本IL-2相近的生物学活性。结论 成功构建了88Arg IL-2的重组克隆，在原核表达系统中高效表达出融合蛋白，并且具有生物学活性。
［关键词］ 白细胞介素2;基因突变;原核表达;蛋白质印迹法;MTT比色法
［ABSTRACT］ObjectiveTo construct clone of88Arg IL-2 and express it in Escherichia coli. MethodsSite-specific mu-tated primers were designed according to natural IL-2 DNA sequence.88Arg IL-2 gene was amplified using PCR. Then the88Arg IL-2 gene was inserted into expression vector pGEX4T-2 and induced by IPTG to express the protein in E. coli DH5α. ResultsThe molecular weight of fusion protein was 42 000. Western blotting test revealed that it had good specificity to anti-IL-2. The result of MTT assay indicated that88Arg IL-2 could stimulate the proliferation of CTLL-2 which was IL-2-dependent cell strain. Conclusion88Arg IL-2 has been cloned; the fusion protein is expressed in prokaryotic expression system with biologic activity.
［KEY WORDS］interleukin-2; gene mutation; prokaryotic expression; immunoblotting; MTT assay
白细胞介素2（IL-2）可诱导T细胞增殖分化，增强CTL的细胞毒性，促进NK细胞、LAK细胞增殖并增强其活性等［1～3］。临床上已经开始使用基因重组IL-2（rIL-2）作为治疗多种恶性肿瘤的药物［3］。但IL-2对靶受体的选择性不高，当与NK细胞表面的中度亲和力受体结合时，会导致NK细胞的过度活化，产生过量肿瘤坏死因子（TNF），从而导致系统毒性。因此，利用IL-2基因定位诱变技术，获得既保持其原有生物学活性又增强对靶细胞作用特异性的变构体就显得尤为重要。本实验利用PCR定点诱变技术，将编码IL-2的第88位酸性氨基酸天冬酰胺（Asn）变构为碱性氨基酸精氨酸（Arg），并将其构建成稳定的原核表达克隆，在此基础上对变构IL-2（88Arg IL-2）融合蛋白进行了抗原性和生物学活性测定，为进一步研究其受体结合特异性，并将其开发成为新型的抗肿瘤免疫药物奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂IL-2克隆由本教研室构建。原核表达载体pGEX4T-2、菌株E.coli JM109和E.coli DH5α均由本教研室保存。pGEM-T Easy载体、PCR试剂、T4 DNA连接酶、PCR产物纯化试剂盒均购自Pro-mega公司。rhIL-2购自晶美生物公司。Anti-hu-manIL-2（Monoclonal antibody）购自PeproTech EC Ltd。Goat Anti-mouse IgG （γ chain specific）购自Southern Biotech Associates， Inc。MTT为Pro-mega公司分装，TRIZOL试剂为Invitrogene公司产品。
1.2 方法
1.2.188Arg IL-2基因克隆的构建及序列测定 用 于构建IL-2基因克隆的引物为上游引物（P3）:5′- ACAATGTACAGGATGCAACT-3′，下游引物（P4）: 5′-TAATTATCAAGTTAGTGTTGA-3′。设计含突变位点的反向互补引物P5、P6。P5:5′-GACT-TAATCAGCCGTATCAACGTAATA-3′，P6: 5′-TATTACGTTGATACGGCTGATTAA-GTC-3′。使用上述4条引物经PCR定点诱变技术得到变构基因片段P3/P6、P5/P4，两纯化片段部分互补，以此为模板， 以P3、P4为引物行PCR扩增获得88Arg IL-2基因。PCR产物纯化后与T-Easy Vector连接，重组质粒标记为T-Easy/IL-2（sa），转化至E.coli JM109，选择阳性克隆，送至上海生物工程技术有限公司进行序列测定。
