脂质体类项目研发解决方案
一、 脂质体介绍
脂质体 (liposome, 又称之为脂小球)，是由磷脂双层膜构成的中空小球。构成脂质体的主要成分是磷脂和其他类脂化合物(见图1)。早在1961年英国学者Bangham和Standish就发现当磷脂分子分散在水中时会自然形成有序排列的类似生物膜结构的多层囊泡。囊泡的每一脂质层均以有序排列的磷脂双分子构成；囊泡中央和各层之间被水相隔开。 后来人们将这种具有双层膜形态的类似生物膜结构的中空小球通称为脂质体。
A B C
图1 脂质体示意图
A: 水溶性药物被包裹在脂质体的水性隔间里
B: 疏水性药物处于双层磷脂分子之间 C: 长循环脂质体脂质体
脂质体技术是被喻为“生物导弹”的第三代靶向给药技术，脂质体作为药物载体可以将大批已知高毒性活性药物安全有效地应用于临床治疗，其中有抗癌药、抗生素类药、抗真菌类药、抗寄生虫类药、蛋白质或多肽类药物、以及基因药物，脂质体药物制剂对提高临床治疗水平，改善广大患者病痛有非常重要的作用。由于其无毒、高效、应用面广，制备简单，无免疫原性及易实现靶向性等优点而倍受临床医生及各大药厂的广泛关注。
目前已生产上市的脂质体药物多属常规脂质体和长效脂质体。常规脂质体利用磷脂组成的双层膜将药物包裹在脂质体囊泡中。其主要功能为降低药物毒性和增强药效，比如：脂质体两性霉素 (商品名，AmBisome)，脂质体阿霉素 (Myocet) 和脂质体柔红霉素 (DaunoXome)。而长效脂质体是表面用聚乙二醇-磷脂衍生物(PEG-lipids)修饰了的脂质体。修饰后的脂质体提高了药物在血液中的保留时间，增加了药物的被动靶向功能。聚乙二醇-脂质体阿霉素(Doxil) 已经在欧美生产上市。
二、 项目案例及技术方案
虽然脂质体的制备可以细分为薄膜分散法、逆相蒸发法、有机溶剂注入法等许多种，但从所要装载的药物性质的不同以及脂质体药物制剂大规模工业生产的角度主要以pH梯度法及薄膜分散法两种，下面将以两个典型案例展示。 2.1阿霉素脂质体（商品名Myocet 及Doxil） 2.1.1阿霉素脂质体概述
多柔吡星(Doxrubicin)为氨基糖苷类抗肿瘤抗生素，其抗癌谱广。但由于存在严重的心脏毒性及胃肠道反应，脱发及骨髓抑制等毒副作用，限制了它在临床上的应用，从70年代末期，许多科学家就已开始对脂质体作为蒽环类药物的载体[4]进行了广泛的研究。在研究初期因大批量制备工艺，稳定性等问题未能很好解决，在相当长的时期内产品一直未能上市。经过科学家长期不懈的努力，目前已有两种盐酸多柔吡星的脂质体制剂上市，一种是Doxil，为治疗艾滋病而得到FDA的特批，Doxil属于第二代长循环脂质体（处方中加入mPEG-DSPE），具有一定的被动靶向作用；另一种是Myocet，与环磷酰胺联合使用作为治疗乳腺癌的一线用药，已获准在欧洲上市。其为第一代脂质体，表面没有任何修饰，但两者技术的核心都是利用脂质体内外pH的差异而使药物被动装载于脂质体内即pH梯度法。
其结构、载药原理及工艺流程图如图2，3，4所示：
图2-1 Doxil结构图 图2-2 Doxil电镜照片
图3 阿霉素脂质体载药示意图 图4 阿霉素脂质体制备工艺图
2.1.2阿霉素脂质体工业化生产技术难点及解决方案
图3所示的工艺在实验室是比较常用的工艺，也是脂质体生产最基本工艺，对于工业化生产具有一定的借鉴，针对于阿霉素脂质体，我们提出以下几点解决方案，以达到工业化放大的需求。 2.1.2.1 MLV脂质体的制备
脂质体的制备是整个环节中最重要的一步，脂质体由磷脂、胆固醇和其他一些辅料组成，可以采用薄膜分散法，但是工业化制备出来的脂质体由于受负压，温度，溶剂量等各个因素的影响导致批间差异性非常大，而且容易造成污染，无法保证最终产品的生物安全性；采用溶剂注入法是一种相对比较好的解决方案，但是难点在于原辅料的溶解性能，要完全溶解，就需要增加溶剂用量或者升高温度，但同时需要保证脂质体中的有机溶剂低于某一百分浓度，避免造成已形成的脂质体重新溶解在有机溶剂中；升高温度会导致磷脂氧化，从而造成成品脂质体的稳定性大大降低，12~24小时后便会产生聚集、融合，粒径变大，从而分层。
针对以上问题，我们采用特殊增溶各种辅料的方式，可以在较低温度下使辅料在有机溶剂中保持良好的溶解性，从而减少有机溶剂在脂质体中所占得比例，同时在较低温度下也可以避免因高温造成的氧化，降低脂质体稳定性。 2.1.2.2 减小粒径，提高稳定性
国外上市的Myocet和Doxil的粒径均在200nm以下，属于LUV型脂质体，因此具有良好的稳定性，对于脂质体粒径减少，目前采用挤压、均质、高速剪切、超声等手段使其粒径达到纳米级，但是以上几种方法存在其不可避免的缺点。
首先，超声，无法工业化，而且实验室可重复性差；其次，高速剪切可以减少粒径，但是工业化提供的高速剪切（10krpm）也不能达到我们所需要的粒径，而且不均匀，粒径分布宽，降低稳定性；
再者，通过高压均质可以降低粒径，也是目前大多数研究单位喜欢采用的一种规模化生产模式，目前常用的均质机有APV和NIRO两种，但是其在均值瞬间温度会比较高，据设备厂商解释，在均值阀附近的温度可以达到250度，这个温度对脂质体由一定的影响，会造成高温氧化，高温水解速率增加，增加了有关物质的含量，从而对安全性有一定影响；
最后，挤压是国外实验室最常用的一种模式，是一种最理想的模式，可以在保证低温，密闭的情况下实现减少粒径，但国外技术封锁，导致国外工业化设备无法进口到国内，从而在规模化上对我们进行限制，减少竞争。
针对于以上过程中的问题，我们采取仿制国外设备，或者对某些国产设备进行改进，从而达到在较低温度下，在密闭的环境中减少脂质体粒径，提高产品的稳定性。 2.1.2.3 脱溶剂
由于采用溶剂注入法制备脂质体，必然导致脂质体中有部分溶剂，该溶剂会影响脂质体的长期稳定性，并且会在注射过程中造成副反应，而且部分溶剂还属于限制性溶剂，所以必须在脂质体制备完成之后立即脱除溶剂，目前最常用的脱除溶剂方法为减压蒸馏、冷冻干燥、喷雾干燥和透析法，但除了冷冻干燥成本高，而且冻干有机溶剂对冻干机有特殊要求，其它三种方法均不能用于脂质体工业
化。
为了解决以上问题，我们采用自制装置，可以在低温，密闭状态下快速、批量脱除溶剂。
2.1.2.4 游离药物的清除
根据国家规定，脂质体的包封率要大于80%，所以在众多研发公司中为了达到这一门槛，纷纷采取技术手段，将多余的游离药物清除，一般采用透析的模式，但是我们所采用的技术其包封率可以达到99%，而且可以保证载药量（包封率要和载药量联系在一起，单纯的考察包封率没有任何意义，因为如果载药量太低，会导致其在体内无法达到起效浓度，更无法达到达峰浓度Cmax），无需进行有力药物的清除，从而减少工业化难度，缩短批生产时间。 2.1.2.5 无菌保证
对于注射剂而言，最重要的是无菌保证，国家药监局自2007年以来对无菌保证给予重点关注，由于脂质体不能耐受高温，所以不能进行最终的热压灭菌，只能采取无菌灌装的模式，为了保证成品质量，在过程中采用0.22um的除菌过滤器进行过滤，以保证产品的无菌安全性。
总之，对于阿霉素脂质体项目（包括Myocet和Doxil）我们的方案重点解决脂质体批量制备，粒径减小，溶剂脱除和游离药物清除几大重点问题，可以保证低温、高效的完成批量生产。
2.2两性霉素B脂质体（商品名AmBisome）
两性霉素B（Amphotericin B）是一种治疗深部真菌感染的多烯类抗生素，对大多数真性致病性和机会性真菌病具有很高的疗效，目前尚无适当的可替代药物。随着抗生素、激素、细胞毒药物的广泛应用及肿瘤化疗、放疗、脏器移植、免疫缺陷疾病导致的全身性深部真菌感染的发病率急剧增加，且有较高的死亡率，因此需要有效的抗真菌药物，但临床使用发现两性霉素B在治疗剂量时会产生比较严重的不良反应，故在使用剂量和应用范围上受到很大限制。
为了降低两性霉素B的毒副作用，合适的递药体系（制剂技术）是一种选择；在各种各样可用的药物载体系统中，脂质体递药技术对两性霉素B成为首
