第二十章 性别决定基因鉴定及性染色体进化
性别决定机制的探讨一直是生命科学研究中最具吸引力和最热门的领域之一。对两性生物而言，性别决定与分化是个体正常发育和生存不可缺少的一环，也是种族得以繁衍延续的物质基础。自古以来，关于性别决定的稀奇古怪的说法很多。随着科学技术的发展，人们认识到雌性和雄性个体在形态、生理和行为的许多特征及基因产物上都有很大的差异，然而它们在遗传信息上绝大部分是一致的，这就更引起了人们的兴趣，去揭示其中的奥秘。至今，对性别决定机制的研究已经形成了由遗传学、发育生物学、分子生物学及进化等多学科交叉的前沿研究领域。性别发育是一个多基因调控的复杂的分化事件，是对两套可轮换的遗传程序之一的精确决定和执行，而其分子机制及其多样性使得性别决定机制的研究成为有关胚胎发育过程中分子调节开关如何起作用的一个丰富的信息源泉。
发育生物学家的目标是追溯出性别决定和分化的基因通路，并以性别决定机制作为一种模式去理解发育的各个过程。同时，研究人员也致力于研究在大脑中是如何导致产生特殊的性行为，以及在不同的生物中，进化是如何产生截然不同的机制而最终获得相同的结果。在无脊椎动物中，研究人员以果蝇和线虫为实验对象，已接近实现这个目标，可绘制出详细的信号传导过程，其研究领先于脊椎动物；在低等脊椎动物中，性染色体的分化程度较低，而且其性别决定受环境的影响较大，研究人员在此领域中一直没有获得突破性进展；在哺乳动物中，已经克隆了一些调控性别决定和分化的基因，追溯出性别分化早期的一部分信号通路，并先后提出了一系列模型来解释哺乳动物的性别决定机制 。由于线虫和果蝇决定性别分化的基因完全不同，哺乳动物又具有不相关的第三套基因，这使得研究人员还无法应用从简单生物中所获得的信息来指导对高等生物的研究（Marx, 1995）。因此，脊椎动物性别决定基因的及其作用机制的研究主要依赖于本身的研究系统。
第一节 哺乳动物的性别决定
一、性别决定基因的鉴定
50年代确立了哺乳动物性别决定的两条规律：第一，性腺的分化决定了性别的分化，这条规律是通过一系列胎兔阉割实验确立的；第二，Y染色体决定雄性，这条规律是在发现性逆转病人的基础上确立的。哺乳动物性别决定基因的鉴定主要也是来自于对性反转动物的研究。事实上经过对性逆转病人三十多年的研究，通过对H-Y抗原、ZFY等睾丸决定因子（testis-determining factor, TDF）候选基因的逐步认识，直到1990年，才由Sinclair等克隆到人类Y染色体该区域内的一个新的候选基因SRY（Sex-determining region Y），同时在小鼠Y染色体相应区域找到了类似基因Sry（Gudday et al., 1990）。经过SRY转基因小鼠实
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验及对SRY表达特征和保守性分析证实，SRY基因就是TDF（Gudday et al., 1990）。SRY基因具有高度进化保守性，在其它较广泛的物种中也发现了SRY的同源基因，包括果蝇、两栖类、鸟类、北美鱼和其它哺乳动物。SRY盒基因的发现及其保守性为性别决定机制等的研究提出了新的研究课题。到具有更低等的进化地位的动物中去寻找性别决定基因或其祖先基因，从进化途径来阐明性别分化发育机制，是该领域研究的热点前沿课题。
SRY基因的发现是哺乳动物性别决定这个研究领域的一项重大突破。然而，最近的研究发现X染色体和常染色体上某些位点的突变也和性逆转有关，这意味着还存在着另一些基因介入了性别决定。近年来，人们已克隆了许多涉及性别决定的基因。至今为止，在哺乳动物中已分离鉴定了一些性别决定基因（表20-1）。
表20-1 哺乳动物中已发现的性别决定基因
基因 缩写 SRY （Sry） MIH （AMH〕 Sox9 WT1 SF－1 全称 sex-determining region Y Mullerian inhibiting substance SRY box gene 9 Wilm tumor gene 1 steroidogenic factor 1 DSS-AHC critical DAX－1 region on the X chromosome ,gene 1 RBM DAZ SOX-5 SOX-6 SOX-17
RNA binding motif Deleted in Azooepermia SRY box gene 5 SRY box gene 6 SRY box gene 17 精子细胞发生 精子细胞发生 精子细胞发生 精子细胞发生 精子细胞发生 决定雌性发育，SRY仅能抑制其一份剂量 为哺乳动物睾丸决定因子，启动睾丸的分化，是睾丸发育负调节的抑制子 使雄性体内的副中肾管退化，阻止其发育成雌性生殖器 与人类睾丸决定有关，突变可导致产生46XY性反转 可能在性别分化的早期参与SRY的激活 可能是AMH基因的直接调控者，是AMH基因激活所必需的，在Sry表达之前启动性腺和肾上腺的发育 基因功能 以前广泛地认为Y染色体上的特异重复顺序是由“无用”DNA组成，而 Bruce等（1997）认为Y染色体由大量的NRY（nonrecombining region of the human Y chromosome, 人类Y染色体非重组区）组成，其上的重复序列区富含基因，包含了大多数NRY的基因的转录单位。他们通过系统地寻找人类Y染色体上非重组区，克隆了12个新的基因或基因家族，
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并将它们定位在Y染色体上。这些基因编码同一类蛋白，并分散在NRY的常染色质区。这12个基因可分为两类：DBY、TB4Y、EIF1AY等5个基因在NRY内为单拷贝，具有类似的性质。每一个在X染色体上都有同源顺序，各编码一个相近的同功蛋白，在人类多个组织中都有表达。而CDY、BPY1、BPY2、TTY1等7个具有与前者完全不同的性质，仅在睾丸中表达，有多个拷贝。其中有一些基因可能编码DNA或RNA结合蛋白，包括两个小的蛋白BPY1和BPY2；两个假定的RNA结合蛋白RBM和DAZ（Reijo et al.，1995）,包含染色质决定子的CDY [一个染色质基序（motif）]。这些由Bruce等克隆的Y染色体上的特异基因为研究脊椎动物的性别决定机制和性染色体的进化提供了有用的工具。
二、性别决定和分化的信号传导途径
人类性别分化始于胚胎第4周，生殖嵴发育成包括皮质和髓质的未分化性腺。男性由髓质分化成睾丸，而皮质萎缩；女性由皮质分化成卵巢，而髓质萎缩。内生殖器起源于中肾管和副中肾管。男胚中肾管分化成精巢、输精管和副睾，副中肾管退化；女胚副中肾管发育成输卵管、子宫和阴道的前1/3部分，中肾管退化。小鼠性腺约在胚胎第10天开始发育，中肾增厚，第12天两性间出现形态差异，可辨雌雄。
研究表明，人SRY基因位于Yp11.3，含有一单个外显子，长850bp，在起始密码子的上游91bp处有一个主要的转录起始位点（Lovell-badge and Hacker ,1995）。SRY基因携带了一个DNA结合结构域HMG（high mobility group），是一个转录因子，通过与其它基因的结合来改变它们的表达。MarcoBianchi等发现SRY蛋白与DNA结合能引起DNA发生70度至80度的弯曲。MariusClove等也通过研究SRY区的HMG功能区和DNA之间的三维复合结构确证了这个结果（Marx ,1995）。SRY-HMG具有一个弯曲的L形结构，以?-螺
旋的凹面与DNA结合（图20-1）（Werner et
SRY-HMG al.,1995）。 SRY蛋白通过插入一无极性的侧链到DNA双螺旋的小沟，并与特殊的核苷酸顺序（5’-AACAATG）结合，干扰碱基堆积（Haqq
图20-1：SRY蛋白的HMG盒与DNA
et al., 1994），引起DNA弯曲，可能是使DNA
以凹面结合的模式图（Werner et
形成环状，将远距离的调节位点和启动子拉近，
al.,1995）
以便调节基因的表达。
小鼠的Sry也只有单个外显子，位于一个2.8 kb的单一序列的延伸部分，侧翼是一个至少15kb的反向重复序列。人类SRY和小鼠Sry的HMG 盒有71％的同源性，但在此区域的外侧无明显同源性。Sry在成年小鼠生殖细胞中表达为一个茎环状RNA，不和多核糖体相连，可能不翻译（Capel et al.,1993）；在鼠胚性腺中，表达为一长4.8kb的线状RNA，所用的启动子也与成年鼠不同。Giese等（1992）的研究表明，鼠的Sry基因和人类的SRY基因的HMG功能区结合DNA，并使DNA发生弯曲的性质不同。Sry基因识别更高特异
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的顺序（5’-CATTGTT），并与DNA的大沟紧密结合。Dubin等（1994）的实验表明小鼠Sry基因有一个DNA结合区和转录激活区。Sry活动在发育上的时间进程是严格的，大约在交配受孕后10.5～11天，Sry基因特异地在生殖嵴中启动（正好是两性间形态分化出现之前），12.5天关闭。因此，Sry基因的功能是启动睾丸分化而不是维持睾丸存在。 近年来又有一些有悖于SRY/Sry决定睾丸发育的报道，SRY基因的突变仅能解释25％的XY性逆转现象，这就意味着可能还有另外一些遗传因子介入了性别的分化。与SRY基因同样重要的是Zanaria等（1994）在DSS基因座（dosage-sensitive sex reveral，剂量敏感性性反转基因）区域内克隆的一个DAX-1（DSS-AHC critical region on the X chromosome , gene 1，X染色体DSS-AHC决定区基因1）基因，与先天肾上腺发育不全基因座（adrenal hypoplasia congenita，AHC）有关，编码核内激素受体超家族的一个成员, 雌性个体中具有两份拷贝，这表明DAX-1基因是卵巢发育所需的。Amanda等（1998）的研究表明，Dax-1的产物是与Sry的产物相互颉抗，Dax-1表达量的增加导致个体向雌性发育，而Sry活性的增加则引导个体向雄性发育。在小鼠中，Dax-1在受孕后11.5天时在生殖嵴中表达，但是在雌雄中表达水平相当，表明Dax-1对Sry的负调节发生在转录后水平。DAX-1能与SF-1形成异二聚体，它可能作为一种辅助抑制因子改变SF-1的性质使其不能激活其目的基因（Ito et al., 1997）。 Haqq等（1994）报道SRY蛋白与缪勒氏抑制基因（Mullerian inhibiting substance, MIS）的启动子结合并激活其表达。研究人员曾认为SRY最佳的下游候选靶基因为抗缪勒氏激素基因AMH（ antimullerian hormone gene，亦称MIS）（Marx, 1995），为转化生长因子β家族的一员，其主要功能是使雄性个体体内的缪勒氏管退化，阻止其发育成雌性生殖器。但SRY蛋白并不结合到AMH调节元件上，将SRY表达质粒和AMH报告基因共转染大鼠胚胎的性嵴细胞系中，表明SRY可以通过间接的方式诱导AMH表达（McElrearey et al. 1993）。 Duke’s Parker等（Marx 1995）的研究结果表明，另一转录因子编码甾类因子的基因SF-1（steroidogenicfactor 1，甾类生成因子1）可能是AMH基因的直接调控者，是激活AMH基因所必需的。在细胞转染实验中，SF1蛋白能与AMH基因的上游序列结合并促进其转录。SF-1属于核内激素受体超家族成员，结构与DAX-1相似，具有分离的配基结合区和DNA结合区，是肾上腺皮质和性腺中甾类合成酶系的一个调控因子。当剔除小鼠体内的SF-1基因时，小鼠缺乏肾上腺、性腺和下丘脑腹中核（Luo et al.,1994），提示SF1在Sry表达之前启动性腺和肾上腺的发育。Ingraham等的研究结果表明SF-1的适度表达需要SRY基因的存在。SF-1基因在性腺中的表达具有性别二态性。早期雌雄鼠胚均转录SF-1，但交配受孕后12天（两性间出现形态差异）时，雌性SF-1表达水平降低。Sry基因可能通过SF-1来激活AMH基因（Marx ,1995）。因此，SRY、SF-1和AMH依次作用决定哺乳动物的性别（图20-2）。
在SRY-ORF 5’端4.0kb处有一个790bp的CpG岛，可能是WT1（Wilms tumor gene，魏尔门瘤基因）基因的潜在识别位点，表明WT1可能在性别分化的早期参与SRY的激活（Marx,1995）。WT1编码一个转录因子，剔除该基因的小鼠也缺乏性腺，但它对性腺发育的影响可能从属于一个依赖SF1的途径（McElreavey,1995）。
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?DAX-1
生殖嵴
SF1,WT1
未分化的性腺
SRY,?Sox9
卵巢 膜细胞 卵泡细胞 卵泡 副中肾管 睾丸 足细胞
AMH
SF1
睾丸间 质细胞
SF1
睾酮
中肾管
雌性内雄性内生殖器 副中肾管 被抑制 生殖器
DHT 生殖结节尿殖窦
阴茎 前列腺
图20-2 哺乳动物性别决定中相关基因的功能。（自Marx, 1995）
位于17q24.1-25.1的SOX9（SRY box gene-9）基因的突变可造成严重的骨质形成异常（CD campornelic dysplasia）和46XY性反转，Schafer（1995）认为SOX9可能是一个转录因子，是哺乳动物性别决定通路的成员之一，与睾丸的决定相关。SOX9是一个常染色体基因，其开放阅读框内的失活突变或者上游（17q24-25）的易位均可致病。突变只存在一个等位基因，提示性反转可能与SOX9蛋白的剂量有关。但仍未确定SOX9作用于性别分化的哪一个环节。
近10年来产生了几种哺乳动物性别决定的模型，但多数未能完满的解释各种性反转的情况，而McElreavey等1993年提出的Z-基因模型，Bardoni等1994年提出的DSS-基因模型，Jimenez等1996年提出的模型（图20-3）是其中较好的几个。Jimenez等认为单拷贝的活性DSS能在正常的XX雌性中阻碍雄性发育途径（图20-3b），但在XY雄性中则受到SRY基因的作用失活（图20-3a）。
三、调控配子发生的相关基因
体细胞将随着个体生命的结束而消亡，生殖细胞却随着物种的繁衍而永存。因此，了解生殖细胞性别分化的意义更为深刻。但由于检测发生性逆转的生殖细胞没有检测发生性逆转的体细胞容易，目前对调控配子性别分化机制的认识还远不如体细胞的清晰。就已获得的资料看，二者是迥然不同的。与体细胞相比，生殖细胞的性别分化机制更为复杂一些。 在哺乳动物中，生殖细胞的性别表型不依赖于其本身的基因型，而是依赖于其周围性腺组织的性别表型。在小鼠中，大约在交配受孕后10～11天时生殖细胞迁移至生殖嵴，增殖2～3天后显示出性别差异。在卵巢中生殖细胞进入减数分裂，然后停止在第一次减数分
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