对于蔡元培以党国元老和中央监察委员的身份参与组织民权保障同盟活动，南京国民党当局极为恼火，不断加以恐吓、威胁，指责他的行为“徇于私情，曲加保护，为反动张目”，“破坏本党威信，逾越中委职权”，宣布同盟为非法组织。对此，蔡元培进行积极的抗争。2月9日，他在报刊上发表谈话，公开声明，“本同盟组织之目的为保障人权促进法治，宗旨纯正，态度光明，绝对不能谓为‘非法’。反之，凡一切反对本同盟之主张，则恰为非法”。
1933年6月18日，民权保障同盟总干事杨杏佛遭蓝衣社特务枪杀身亡。面对国民党特务的子弹威胁，蔡元培也没有被吓倒。事情发生后，他于当日上午9时即驱车赶至现场，然后前往医院审视遗体，接着开会讨论善后事宜，一面代表家属，聘请律师，进行法律交涉，同时致电林森、汪精卫，要求立即“饬属缉凶，以维法纪”。20日，蔡元培亲自主祭并致悼词。表达他对痛失斯人的沉痛哀悼，并表达了他随时准备为保障人权而牺牲生命的坚强决心。
在追求和捍卫民主的过程中，蔡元培同时坚持反帝爱国思想。1928年北伐刚完成，他就在国民党第二届五中全会上提出《关于外交问题提案》，要求将废除不平等条约列入国民政府的议事日程，把国民革命进行到底。
“九一八”事变发生后，蔡元培大力宣传抗日，力促蒋介石国民党政府改变消极抗战政策，实行全民抗日。1933年1月，他在赠给鲁迅的二首七律诗中，对蒋介石“攘外必先安内”的政策作了严厉的鞭挞，诗云：“养兵千日知何用，大敌当前暗不声。汝辈尚容说威信，十重颜甲对苍生。”“几多恩怨争牛李，有数人才走越胡。顾犬补牢犹未晚，祗今谁是蔺相如。”1934年，在赴南京出席行政院院长兼外交部长汪精卫举办的宴饮上，他又苦劝汪改变亲日政策，语重心长地说：关于中日的事情，我们应该立定严正的态度，以大无畏的精神，推进抗战的国策，由我们到我们的后辈一直抵抗下去，一定有出路。在写给一位友人的
信中，他进一步表达了希望结束国民党一党专政，实行国共合作、共赴国难的愿望。
由于蔡元培坚持民主抗日的进步立场，他在当时就受到中国共产党人的欢迎和赞许。1936年9月，中共中央主席毛泽东亲笔致函蔡元培，对他的言行给予高度赞扬，并希望他为促成国共合作、实现全民抗日作出更大的贡献。 1937年上海沦陷后，蔡元培移居香港，仍然十分关心中国内地的抗战，不顾自己年老体弱，继续从事抗日宣传活动。1938年5月，他应邀出席保卫中国大同盟和香港国防医药筹赈会举办的美术展览会开幕式，发表精彩的演说，将美术与抗战联系起来，指出：美术作品所表现出来的宁静和强毅的精神，不但前方冲锋陷阵的将士不可不有，就是后方供给军需，救护伤兵，救济难民以及其他从事不能停顿之学术或事业者，亦不可不有之；有了这种精神，始能免于疏忽、错乱、散漫等过关，始能在全民抗日中担得起一份责任。1939年12月，就在他病逝前三个月，还用《满江红》词调，亲自为国际反侵略运动大会中国分会撰写会歌，对中国的抗战事业充满必胜信念，其歌云：“公理昭彰，战胜强权在今日。概不问，领土大小，军容赢诎。文化同肩维护任，武装合组抵抗术。把野心军阀尽排除，齐努力。我中华，泱泱国。爱和平，御强敌。两年来博得同情洋溢。独立宁辞经百战，众擎无愧参全责。与友邦共奏凯旋歌，显成绩。”
然而，蔡元培毕竟年事已高，没有能够目睹抗战的胜利，便于1940年3月5日9时45分在香港九龙寓所溘然长逝，享年73岁。
