表 2 p值对标准 B H一葡萄糖苷酶活的影响
为了进一步考察 p H值变化对纤维素酶蛋白结构与催化功能的影响是否具有可逆性，行了 p进 H回调试验分析各酶活。试验结果 ( 1表明 E表 ) G和 C H酶活分别恢复到对照的 9%和 8%以上， B 2 7而 C B酶活几乎丧失，合 F A酶活也只有 4%左综 P 0右。与此同时，购自 Sg用 ima公司的标准{~葡萄 3糖苷酶进行 p试验，出现了类似的结果 ( 2。 H也表 )因此，B酶活性对 p值十分敏感，变性具不可 C H并逆性。这可能是在酸性条件下，浓度可以影响口 H一
蛋白浓度增加了 1倍， F A酶活却只增加了但 P
45 .%。由于葡萄糖是 C B酶抑制物",]纤维二糖能强烈抑制 C H酶的活性。纤维二糖可结合在 B] C H酶活性部位附近的色氨酸残基上形成“阻效 B位
%
应”从而阻止纤维素分子链进入活性中心。同时，,C H酶分子构象发生较大变化，使吸附纤维素后 B致不能导致微纤维的分离，而成为“无效吸附”。添加 3 J一葡萄糖苷酶之后，随着酶解反应的进行，萄糖葡
∞∞ m¨
的积累必然抑制 8一葡萄糖苷酶的活性，造成纤维二糖的积累，而抑制纤维素酶各酶的活性，成进造F A酶活提高不多。 P袁 4添加 C B酶 F A酶活变化 P
葡萄糖苷酶位于活性位点的色氨酶残基微环境，勰勰勰∞
使酶分子构象发生了变化，影响酶与底物结而合 u也可能因∞H值的变化对酶蛋白结构造成改 ; p虬%∞变，形成了不可逆变化，以酶活没有得到恢复。所2 3添加纤维素酶各单酶组分对酶解作用的影响 .
为了确定纤维素各单酶组分对本试验分离的纤
维素酶总酶活的作用，因此进行各酶添加试验。 在 B液中添加各单酶，然各种单酶蛋白浓度虽和酶活并不相同，但是添加之后的各酶活都比不添加时有所提高 ( 3。添加 E表 ) G酶后，虽然 E G酶活提高了 9 1但 C H, B与 F A酶活没有明显增 .%, B C P加；添加 C H酶，G酶提高了 7 4, C B E .%而 B酶活没
通过以上分析，为 8认一葡萄糖苷酶在发酵得到的纤维素酶系中是限制性酶，系中添加 p酶一葡萄糖苷酶单酶可以提高 F A酶活；外添加过多的 P另
酶，分解底物后产生的葡萄糖会产生较强的葡萄糖阻遏效应，者添加的 8一葡萄糖苷酶解除了其自或 身的限制性作用，得外切酶或内切酶成为限制性使酶，得 F A酶活不能提高更多。在发酵的动态过使 P程中，过 p控制，方面 p的变化改变一萄通 H一 H葡
有明显提高，P F A酶活提高 6 5当添加 C .%; B酶，可以有效的减少纤维二糖的对 C H酶的抑制作用， B
进而提高 E G酶活，而使 F A总酶活也相应提高从 P了 1 .%, P比酶活由 1 . U/ 11 F A 9 3 mL提高到 1 . 98
糖苷酶构象，而提高其酶活，P酶活也相应提从 FA高，进底物水解；促另外一方面菌体利用底物水解产生的葡萄糖，以解除积累葡萄糖的抑制，而保证可从
U/
。由此也可以看出纤维素酶各组分酶之间酶 mU解纤维素时存在协同作用。——
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第5期
耿冰，:H值对绿色木霉 ( rcoem iie产纤维素酶的影响等 p T i dr avr ) h d酶构象变化，稳定性下降。
第 3卷 8
整个酶系对纤维素的酶解，而促进菌体生长，生进产更多的酶蛋白。
在 p . H 5 0时酪氨酸在峰位 8 1c的峰强明 5 m
2 4 p葡萄糖苷酶拉曼光谱分析 . .对 p . H 5 0和 p 2 0两种情况下的 l葡萄糖苷 H . 3一酶拉曼分析，图如图 4其拉曼频移和归属指认见谱，表 5引。 E
显低于 8 4 m的峰强，得 j5,3< 1而在 3c 可 8/ 0 0;
p 2 0时其在峰位 8 3c 1峰强明显高于 83 H . 4 mI的 3c的峰强，得 I5 I。 1 m可 8/≥。由此可知，一萄 o,葡糖苷酶溶液在 p 5 0时酪氨酸为“藏式”当 H .埋， p .为“ H2 0时暴露式”。在色氨酸残基的一系列谱带中，3 4c的峰强在 p 5 0比 p 2 0时明显高 1 6 m H . H .出很多，而且是尖锐的峰形；H ., p 2 0时峰形变为不明显的平峰。可见在 J葡萄糖苷酶在 p . 3一 H5 0时色氨酸为“藏式”而在 p为 2 0时是“露式”埋， H .暴。拉曼光谱检测出 8葡萄糖苷酶在 p .活一 H5 0有性状态下，酶蛋白主链结构主要为 a螺旋和无规则一卷曲； p .有活性状态下，蛋白主链结构在 H2 0没酶的无规则卷曲发生较大变化，一 a螺旋也受到一定影
图 4p 50 p 20 H .和 H .下葡萄糖苷酶的拉曼光谱图() p- .; a:t o I 5 ( )p 2 0 b:H .
响。这说明 p H对 J葡萄糖苷酶构象的改变是造成 3一其活性变化的主要原因。
表5 p . H5 0和 p . H2 0下 j葡萄糖苷酶的 3一拉曼光谱图和特征频率归属
3结论J葡萄糖苷酶是绿色木霉发酵产纤维素酶系中 3一的关键酶组分，其酶活对 p H值敏感，最适 p在4 8 H .
左右，酶活催化功能因 p变化而发生不可逆改其 H变。通过控制发酵过程 p可明显提高菌体浓度和 H胞外蛋白浓度，分别达到
3 .%和 0 7/ 35 .2mgmL,比不控制 p值时分别提高了 2 .%和 4%; G、 H 18 3 E C C H和 F A酶活分别为 1 0 0 mL, . 5 B、 B P 2 . U/ 1 7 U/在 p . H 5 0的 j葡萄糖苷酶溶液中， 3一酰胺 I谱带出现在 1 4 m和 16 m~, 6 5c 6 6c酰胺Ⅲ谱带分别出现在 1 4 r和 1 8 m ( 4。由此表明， 20c n 2 1c图 )在溶液中 p . H 5 0的 J葡萄糖苷酶主要含有 a螺旋结 3一一
mL,.5u/ 1 .u/ 0 81 mL,50 mL是不控制 p值的 2 3 H .倍、 1 7、 .和 2 1。酶系中添加 J葡萄糖 1 .倍 1 7倍 .倍 3一苷酶单酶可以提高 F A酶活。发酵的过程中控制 P p改变 I葡萄糖苷酶构象，高其酶活， P H, 3一提 F A酶活也相应提高，底物水解提高，菌体利用底物水解产生
构和无规则卷曲结构 ( 5。在 p 2 0的 j葡萄表 ) H . 3一糖苷酶溶液中，酰胺 I带出现在 1 5 m~,谱 6 8c酰胺Ⅲ谱带分别出现在 1 8 m~。而在 p .出现 2 8c H5 0时的酰胺 I带 1 6 m和酰胺Ⅲ谱带 1 4 m谱 6 6c 20c并没有很强的吸收峰。这两个谱带正是无规卷曲结构对应的谱带，明在 p .时候，一葡萄糖苷说 H2 0的 8
的葡萄糖，除葡萄糖的抑制作用，而保证整个酶解从系对纤维素的酶解，进菌体生长并产生更多的酶促
蛋白。通过拉曼光谱检测了 8葡萄糖苷酶在 p 50一 H .和 p 2 0两种情况下的光谱图。实验结果表明在 H . p . H5 0有活性状态下，蛋白主链结构主要为 a螺酶一旋和无规则卷曲； p .有活性状态下，蛋在 H2 0没酶白主链结构的无规则卷曲发生较大变化，一 a螺旋也受到一定影响。说明 p对 8葡萄糖苷酶构象的改 H一变是造成其活性变化的主要原因。
