保温 lh之后， Na H(0回调 p 用 O 1%) H值至4 8再 .,保温 1h测定各酶活。 以标准 j葡萄糖苷酶 ( B)自 Sg a公司 3一 C购 im ( . 1I mg来源苦杏仁 )配成 0 1 gmL溶液 7 2 U/,, .m/进行以上 p H值试验，为对照。作1 8添加纤维素酶单酶对纤维素酶酶活影响试验 .
1 5 1茵浓 ( ak dmye u v l, MV) . . P c e cl m ou i me P 在发酵过程取 1mL发酵液， 0 0/ i心 0 4 0 r n离 a r
1mi, 0 n测定其固体沉淀体积，换算为菌体占取样体积的百分比为菌浓 ( MV)上清液作其它分析用。 P,1 5 2上清液蛋白浓度 ..
采用考马司亮蓝法 n。引1 5 3上清液还原糖及酶活测定 ..
发酵上清液 ( H4 8经透析袋浓缩后得到浓缩 p .)
液，适当稀释为 A液。A液稀释 1倍得到 B液。再 B液稀释 1得到 C液。A液蛋白浓度为 B液的 1倍 倍，的 2倍。 C液 浓缩液经过分离后【得到各单酶组分， B l¨, C H酶 (,4 mg 0 05/ 0 8 U/, . 2mgmL) E酶 (7 3 n,,G 4 .U/g a 0 05/ .1mgmL)C,B酶 (.7 rg 00 1/ ) 86 u/,.1mgmL。 n以 C液不添加单酶时测得各酶活为对照。B液
还原糖测定：采用 D NS法 _ 1。
综合滤纸酶活力 ( P: F A)表征纤维素酶综合酶活力，文献进行【 按 1
。
内切葡聚糖酶活 ( G)表征纤维素酶组分内切 E:酶活力，文献进行‘ 按 1。 B葡萄糖苷酶活 ( B测定：征纤维素酶组分一 C)表
l 3葡萄糖苷酶活力，按文献进行n 。以上三种酶活均为扣除发酵上清中还原糖浓度后计算得出，活单位 (定义为：反应条件酶 U)在
与分离得到的各 C H,G,B单酶溶液等体积混合 B E C后，定各酶活和蛋白浓度。测以 B液不添加单酶时测得 F A酶活为对照。 P
p 48 0 1 o L醋酸缓冲液) 5℃恒温 1, H . ( .m l/,0 h以水
分离得到的 C B酶单酶溶液浓缩一倍得到 C 2酶 B
第5期
耿冰，:H值对绿色木霉 ( r h d r iie产纤维素酶的影响等 p T i o emavrd ) c
第 3卷 8
液，蛋白浓度为 C B的一倍。A液与 C B酶液和 C 2 B酶液分别等体积混合后，测定各酶活和蛋白浓度。1 9 p葡萄糖苷酶拉曼光谱分析 . .采用本实验室分离得到的 j葡萄糖苷酶，度 3一浓为 01/ .mgmL的水溶液。取酶液在 p 5 0和 p 2 H . H . 0下进行拉曼光谱分析。 样品的拉曼测试均在室温 (2 ) 2℃下进行。采用英国 R nsa公司生产的激光显微拉曼光谱仪， ei w h型号 ( Vi十R f x .发激光波长 7 5 m, i a e e )激 n l 8 n出射功率 30 0 mw。每个样品都重复扫描 3次以上，样品的各拉曼谱图都由计算机作信号累加平均并绘图输出， 峰位误差小于±3m~。 c图2 E C G、 B与 C H酶活随时间的变化 B—— c n r lp—一 o to H. ‘ ’’wi o tp c n r l t u H o to h—
凸_ EG
— o— CB
—
CBH
2结果与讨论21 p . H值控制下纤维素酶发酵结果对 T, i d vr e进行 p控制与不控制的纤维素 i H酶发酵试验，结果如图 1 2,。
2 2 p对纤维素酶各单酶酶活影响 . H
通过 p H控制提高了 C B酶活，进了菌体生长，促
而使 F A酶活提高， P但纤维素酶是多组分酶，需进一步确定 p I 4是对哪一组分起到了作用。对发酵得到的纤维素酶液， Na H调节 p为 2 4 2 7 3 0用 O H .,.,., 3
9 4 85 8 7 0测定 F A、 G、 B C H酶活和蛋 .,.,., ., P E C、B白浓度， p以 H为 48时测定酶活 F A, G (,B . P E, t C H酶 2 3活分别为 1 . U m,2 u mL 1 7 U r, .5 u 5 0/ L 10/, . 5/ L 0 81/ n mL和蛋白浓度 07 m/ U为 10k,,,2 gm 0 o结果见图 3。
图 1上清液蛋白浓度和 F A酶活随时间的变化 P—— c n r lp ‘’—一 o to H.。’wi o tc n r l H t u o to h p-- -
o- Pr t i - oen
F A P
十
p H
随着发酵的进行不控制 p时，H在 4即 H p 8h后
下降到 30以下。当控制 p . H时，菌体浓度 P MV提高到 3 .%是不控制 p时的 2 .%的 12; 35 H 75 .倍蛋白浓度为 0 7 mgmL比不控制 p时的0 52/ .2/ H .0 mgmL提高了 4%; P 3 F A酶活为 1 . U/ 5 0 mL是不控制 p时的 7 2 mL的 2 1 ( 1。 H .U/ .倍图 )图 3不同 p值下 F A, G, B, B酶活 H P E C C H---
t- F A—o E 3 - P - G
—
CB
十
CBH
由于不同蛋白的等电点各不相同，同 p值不 H
时 H度不同对蛋白的离子分布和微观结构影响浓不同而引起酶活性的变化。由图 3可知： p值当 H小于 4 8时，H值愈低对纤维素的 E C H和 C . p G、 B B
发酵结束时 E C,B酶活分别为 10 HL G,B C H 2U/1, 17UmL,.5U/, .5/ 08 1 mL是不控制 p值时的22, H .倍 1.和 19 ( 2, C 17倍 .倍图 )而 B酶活提高最多，明说p H值对 C B酶活影响比其它二个酶活影响更大。因此p H控制有利于细胞生长和酶蛋白产生。一 j
等酶活影响愈大， C而 B酶活降低最显著，H在 24 p .处理时 C B酶活则只有 4%左右酶活存留。p H值高于 4 8处理时， G和 C H酶活均在 9%以上， . E B 0而一
第 5期
工
业
微
生
物
第 3卷 8
C B酶活在愈高 p H值下酶活亦愈低，酶活仍维持但在 8%以上。因此低 p 0 H值对纤维素酶液的 E和 G C H酶活有一定影响， B而高 p处理几乎
无影响； H但对于 C B酶活，论低 p还是高 p处理均显著降不 H H一
表 3纤维素酶各单酶组分添加对各种酶活的影响P oen r ti C H B E G C B FP A S eil P p c F A a
ra nn m ) (/ ) u m ) uⅡL (/ l) (/ ) eⅡ e ( L u mL (/ L (/L) u I u T L
低，说明其活性对 p H值很敏感。 表 1 p值回调对发酵上清纤维素 H酶各组分酶活的影响Pr ti o en F A P EG CB CB H
B液添加 C B酶之后，除了 C解 B酶的限制，可能使 C H酶或者 E酶成为限制性酶， A液中 B G而C H酶和 E B G酶浓度是 B液中的一倍，因此在 A液
p 2 4 . ( 6 H .~4 8 9 ):
9 . 26
4 . 22
9 . 22
22 .
8 . 75
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中添加 C B酶之后， P酶活提高到 2 2 1比不添 FA .7,加时提高了 1 .%, 5 1比酶活增加到 2 .U/ g而当 24 n; a A液中添加蛋白浓度高 C B酶一倍的 C 2酶时， B F A酶活就提高到 2 3 9提高了 1 .%, P .5, 9 6比酶活达到 2 . mg( 4。然而，可以看到 C 3 1U/表 )也 B酶
