图1 莽草酸对照品(A)和云南松样品(B)的HPLC色谱图
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备精密称取莽草酸对照品适量，置25 ml棕色容量瓶中，加重蒸水溶解并定容至刻度，摇匀，即得对照品贮备液(每毫升含莽草酸83 μg)。
2.2.2 供试品溶液的制备精密称取样品1 g，置具塞锥形瓶中，加重蒸水100 ml，超声处理(功率200 W，频率33 kHz)90 min，过滤，滤液浓缩到一定程度，定容至25 ml，从中取2.5 ml定容至100 ml，临用前以0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。
2.3 标准曲线的制备精密吸取莽草酸对照品贮备液(83 μg·ml-1)1，6，10，15，20 μl注入色谱仪中，以选定的色谱条件进行测定，记录色谱图及峰面积。以峰面积的积分值定量，以进样量(μg)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，并进行回归分析，求出线性回归方程为：Y=3834.9X+3.717，r=0.999 9;结果莽草酸在0.083～1.66 μg范围内与其峰面积的积分值呈良好的线性关系。
2.4 精密度实验按“2.1”项下色谱条件，精密吸取莽草酸对照品10 μl，重复进样5次，测得色谱峰峰面积平均值为3187.87，RSD为0.103%，显示精密度良好。
2.5 重复性实验精密称取同一批云南松松枝干燥粉末5份，按“2.3”项下操作，精密吸取10 μl溶液，按“2.1”项下色谱条件进样检测，莽草酸峰面积积分值的RSD为0.87%，显示重复性良好。
2.6 稳定性实验取松枝供试品溶液，在“2.1”项下色谱条件下，于0，4，8，16 h分别测定莽草酸峰面积，计算峰面积的RSD为1.52 % ，表明供试液在16 h内稳定性良好。
2.7 加样回收实验精密称取已知含量的云南松松枝粉末约0.1 g，共6 份，分别精密加入一定量的莽草酸对照品，按供试品溶液制备及测定法操作，分别进行色谱分析。结果见表1。结果表明，其平均回收率为99.12%，RSD为1.16%，符合分析要求。
2.8 样品测定按“2.2.2”方法制备各样品供试液，精密吸取样品供试液和对照品溶液各10 μl，分别注入高效液相色谱仪，依法测定，按外标法计算。结果见表2 表1 莽草酸加样回收率表2 云南松中莽草酸的含量%
3 讨论
3.1 供试品溶液的制备方法的选择实验中分别考察了超声提取、加热回流、索氏提取等方法的提取效果，以超声提取法最为省时，提取效率最高。而超声提取法中，又分别比较了不同的溶剂(重蒸水、甲醇、95 %乙醇)、不同的超声时间、溶剂不同体积倍量的提取效果，实验表明以100倍量的重蒸水为提取溶剂，超声90 min，可将植物各部分中的莽草酸基本提取完全。
3.2 流动相的选择实验比较了甲醇-水、乙腈-水等流动相系统[7，8]，从分离情况和出峰时间等综合分析选择甲醇-1 %磷酸水溶液等度洗脱为佳，且保留值适宜，柱后处理简便、省时。
3.3 检测波长的选择用二极管阵列检测器在本实验溶剂体系条件下，分析了莽草酸对照品色谱峰和样品中目标组分相应色谱峰的紫外光谱，结果保留值相同处紫外光谱基本一致，莽草酸在214 nm处有最大吸收。待测组分与杂质峰基本能基线分离，检测灵敏度高，确定莽草酸检测波长为214 nm。
目前，莽草酸主要来源于八角属植物八角茴香等果实中[9]，但资源十分有限，无法满足市场的需求。在禽流感病毒的肆虐下，对含有莽草酸的植物进行筛选，通过定量检测为莽草酸提取原料建立科学的依据，具有现实意义和积极作用。结果表明，云南松不同部位均含有莽草酸，松针和松塔含量较高，松枝次之，树皮含量较低，为合理地利用云南松各部位的质量研究提供了实验依据。云南松松针、松塔等是云南松的主要副产物，再生速度快，且可持续利用，较之从八角茴香中提取莽草酸，原料广泛，开发成本低廉。由于云南松资源丰富且莽草酸含量较高，因此云南松中莽草酸的开发将有巨大的潜力。
