1 材料与仪器
1.1 细胞株胃癌MGC-803细胞购于中国科学院上海生命科学研究院,细胞以1×105/ml接种于培养瓶中，加入含有10%灭活的胎牛血清、100 IU/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的RPMI-1640完全培养液，置于37℃恒温，5%CO2及饱和湿度的培养箱中培养，细胞贴壁生长，每2～3 d传代1次。当细胞长到80%时传代，用0.25%胰蛋白酶消化，弃去胰酶，加入新鲜培养基吹打均匀，按1∶3传代。
1.2 药物树舌多糖(含量30%)购于哈尔滨乐泰药业有限公司岔林河中药提取厂。按照文献[8]醇沉和去蛋白得到实验所用的树舌粗多糖。PBS溶解配成浓度为40 g/L原液，微孔滤膜滤过除菌，4℃冰箱保存，用时将完全培养基稀释到所需浓度。
1.3 试剂RPMI-1640培养基为美国Gibco公司产品;标准胎牛血清为天津灏洋生物制品科技有限责任公司产品;DMSO、MTT为美国Amresco公司产品;细胞周期染色溶液为北京联科公司产品;FITC-EGF Receptor为美国BD产品。
1.4 仪器酶联免疫检测仪(5082型)奥地利TECAN公司;流式细胞仪(FACS Calibur)美国BD公司;荧光显微镜为日本Olympus
2 方法
2.1 树舌多糖对胃癌细胞增殖的影响取对数生长期细胞离心后,调整细胞浓度为5×104个/ml，200 μl/孔接种于96孔培养板中，共加3块板，培养24 h。实验设空白组(完全培养基)、细胞对照组和多糖处理组(终浓度为0.125，0.25，0.5，1.0，2.0 g/L)。分别培养24，48，72 h。实验终止前4 h加5 mg/ml MTT 20 μl/孔，4 h后弃上清液。每孔再加入DMSO 150 μl，振荡器充分振荡10 min后，以空白组调零，在酶联免疫检测仪波长570 nm处，测定各组吸光度值(OD值)并计算增殖抑制率。细胞增殖抑制率(%)=(1-用药组平均OD值/对照组平均OD值)×100%。实验重复3次。
2.2 树舌多糖对细胞周期分布的影响 培养72 h后，收集细胞无水乙醇中固定 10 min，避光孵育30 min,流式细胞仪上机检测细胞周期，实验重复3次。
2.3 树舌多糖对EGFR表达影响
2.3.1 流式细胞仪检测EGFR表达培养72 h后，收集细胞，2%多聚甲醛2 ml 37℃固定10 min,孵育30 min。洗涤细胞，封闭10 min，加10 μl抗体，室温避光30 min，去上清，加0.5 ml PBS重悬细胞，流式细胞仪上机检测，实验重复3次。
2.3.2 荧光显微镜观察EGFR的表达把处于对数生长期的细胞培养24 h。按细胞对照组和树舌多糖组，分别加入完全培养基和2.0 g/L树舌多糖，培养72 h。PBS冲洗，加入无水乙醇，固定20 min，封闭30 min。按1∶50稀释抗体，孵育1 h，荧光显微镜下观察，照相。
2.3.3 统计学分析SPSS13.0统计软件进行统计学处理，采用t检验，所有数据以 ±s表示，P<0.05表示差异有统计学意义。
3 结果
3.1 树舌多糖对MGC-803细胞增殖抑制作用MTT检测结果显示树舌多糖抑制MGC-803细胞的增殖，并呈时间和剂量依赖性，即随着药物浓度的增加和作用时间的延长，细胞增殖抑制作用明显加强。2.0 g/L树舌多糖作用72 h后对MGC-803抑制率为45.2%。结果见图1。
图1 树舌多糖对MGC-803细胞增殖抑制曲线
3.2 树舌多糖对细胞周期分布的影响MGC-803细胞在2.0 g/L树舌多糖作用72 h后，收集细胞上流式细胞仪并检测分析细胞周期分布，经ModFit LT for macv3.0软件分析结果：树舌多糖使MGC-803细胞的G0/G1期细胞比例有所增加，而S、G2/M期细胞比例下降，差异有统计学意义(P<0.05)。结果见表1及图2。表1 树舌多糖对MGC-803细胞周期的影响
3.3 树舌多糖对MGC-803细胞EGFR表达的影响 2.0 g/L树舌多糖作用72 h后，荧光显微镜及流式细胞仪结果显示树舌多糖组荧光强度较细胞对照组明显减弱，即EGFR表达减少。结果见图3～4。
