1.6 抗汞质粒基因文库的构建
参照分子克隆手册提取Enterobacter dissolvens sp. YH16质粒和pBluescript sk(-)质粒[5]。YH16质粒DNA首先经HindⅢ、BamHⅠ、PstⅠ、EcoRⅠ小量不完全酶切后电泳，选取最佳内切酶HindⅢ。再经HindⅢ大量不完全酶切后电泳，按照3 s DNA Gel Purification kit试剂盒说明书割胶回收6～10 kb片断。pBluescript sk(-)经HindⅢ 酶切后去磷酸化后并电泳，割胶回收。将酶切并回收的DNA片断与去磷酸化的克隆载体按5∶1的比例16 ℃连接过夜，转入大肠杆菌XL1，并涂布LA平板，进行蓝白斑筛选。
1.7 目标亚克隆的筛选
挑取白色转化子至LB液体培养基中，37 ℃摇床培养10 h左右后(A600控制在1.5左右)，以1 %的量接入含HgCl2 20 mg/L的LB液体培养基中，30 ℃、160 r/min培养1 d，分批处理样品，再用原子吸收光谱测量LB中的汞[4,6]。同时提取质粒酶切验证。
1.8 亚克隆测序与分析
测序由上海博亚生物公司完成。对插入片断通过ORF Finder (open reading frame finder) (http://ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf)寻找读码框，并采用BLASTn (http://ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/cgi?)进行同源性分析。
2 结果与分析
2.1 菌株Enterobacter dissolvens sp. YH16的质粒消除
用传统的碱裂解法提取Enterobacter dissolvens sp. YH16质粒并电泳证实，YH16含有细胞内质粒。质粒消除后，分别挑取抗汞活性丢失菌株与未丢失抗菌活性菌株以碱裂解法小量提取质粒后电泳，结果见图1。实验发现，抗汞活性丢失菌株质粒已丢失，说明抗汞基因可能位于质粒上。
2.2 菌株Enterobacter dissolvens sp. YH16质粒直接转化大肠杆菌实验
质粒可以在不同的微生物之间迅速转移，并赋予受体菌相应的基因型与表型变化，选择将YH16的质粒转化进入与溶解肠杆菌亲缘关系非常近的大肠杆菌XL1中，获得转化菌株YZXL1。结果表明，获得了YH16质粒的YZXL1拥有了抗汞能力，最高能在含HgCl2 40 mg/L的LB培养基上生长，24 h去汞率高达72.2%，处理不同时间后汞残留量见图2。
对YZXL1提取质粒发现，其质粒电泳图与YH16原始质粒完全相同，结果见图3，说明它们来自于同一质粒。
2.3 菌株Enterobacter dissolvens sp.YH16质粒DNA的提取和不完全酶切
分别使用HindⅢ、BamHⅠ、PstⅠ、EcoRⅠ不完全酶切YH16质粒DNA，并电泳检测，结果见图4，确定HindⅢ为最佳内切酶。
2.4 连接、转化以及转化子的检验
用去磷酸化的载体与纯化后的酶切片段连接过夜，纯化后电击转化XL1。取100 μL的菌液涂布到添加了Xgal、IPTG和20 mg/mL HgCl2的LA平板上，30 ℃培养过夜，获得白色菌落3个，分别命名为YZ161，YZ162，YZ163。将单菌落接种到含有20 mg/mL HgCl2的LA液体培养基中培养并甘油保存。
检验3个亚克隆的抗汞活性。研究发现，克隆子YZ163具有最高的抗汞活性，24 h汞去除率为53.6 %，处理后的汞残留量结果见图5。
2.5 阳性克隆YZ163的质粒酶切验证与测序
挑选降解率高的阳性克隆子YZ163提取质粒并酶切，结果见图6。从图中可知，YZ163连接上了大约6 kb和1.5 kb左右的2个片段。将其送至生物公司测序，测序结果略。
2.6 序列分析
通过测序与ORF分析发现，YZ163所含重组质粒上的插入基因全长为7 488 bp， 其中mer操纵子长达
6 048 bp，由7个ORF组成。经blast发现，7个ORF依次为merT、merP、merC、merA、merD、tnpA、tnpA，与典型的Tn501 mer操纵子Tn21 mer操纵子相似[7]。
将7个ORF序列进一步比对发现，tnpA与Enterobacter aerogenes plasmid R751 来源的tnpA 100%同源(genebank：AAC64438.1)。merT、merC与其他种属来源基因差异较小，尤其与Pantoea agglomerans来源的merT、merC仅有5个氨基酸的差别(genebank：CAA70196.1;genebank：AAM44225.1)。merA、merP、merD 与Klebsiella pneumoniae来源的merA、merP、merD同源性很高(GenBank:AAM44226.1;GenBank: AAM44224.1;GenBank: AAM44227.1)，但merA N末端缺失82个氨基酸。
