2.5 图像分析软件定量分析每一玻片任选10个视野，计算在200倍光镜下检测凋亡阳性细胞的个数、平均面积和平均灰度［3］。数据统计学分析用SPSS 10. 0统计软件（t检验）。
3 结果
3.1 倒置显微镜下观察对照组细胞呈梭形，贴壁牢固、密集，折光性好，胞质饱满；实验组中经20 μg/ml TCS作用48 h后细胞间隔增大, 细胞体积缩小，胞浆凝缩，折光率增强，贴壁性差；60 μg/ml TCS浓度作用48 h脱落细胞数增加, 细胞表面出现发泡现象；TCS药物浓度达到100 μg/ml作用24 h后即出现上述特征。
3.2 荧光显微镜下观察经吖啶橙荧光染色后，长链的DNA在荧光显微镜592 nm波长紫外线激发下发出绿色荧光，而RNA发出黄色或黄绿色荧光。本实验的阴性对照组的细胞核DNA为绿色均匀荧光（图1）；各实验组均可见到凋亡的细胞：细胞膜完整，细胞核或细胞质可见致密浓染的黄色荧光，出现凋亡小体（图2）。
3.3 透射电镜观察阴性对照组细胞表面微绒毛丰富，胞质内可见线粒体、粗面内质网、游离核糖体，核仁明显，未发现凋亡细胞（图3）。TCS处理细胞可见明显的细胞凋亡：细胞膜完整，染色质局部增多且趋边凝聚，核固缩，有凋亡小体形成；部分细胞表面微绒毛减少或消失，胞质可见大量空泡结构；细胞核趋边，呈半月形；有的细胞核碎裂为一个或多个致密小体（图4）。
3.4 TUNEL法检测结果TCS处理细胞后24 h，采用TUNEL法染色细胞核呈棕黄色的细胞判为凋亡细胞，未被染色为非凋亡细胞。阴性对照组未见凋亡细胞，而阳性对照组和各实验组均可见大量的胞核棕黄色染色细胞，采用图像分析软件定量分析阳性细胞（表1）。表1 TCS作用Caski细胞后图像定量分析结果（略）
表1中凋亡细胞数量显示，在一定浓度范围内（20 μg/ml到60 μg/ml），随着TCS浓度逐渐增加，凋亡细胞的数量也随之增多；TCS的剂量从60 μg/ml增高到100 μg/ml，凋亡数减少；剂量为60 μg/ml时，凋亡数最多。
由表1中的单个细胞平均面积数可以看出，除60 μg/ml 的TCS剂量组略大于阳性对照组外，其它各剂量组的平均面积均显著大于阳性对照组（P<0.05）。
由表1中的平均灰度可以看出，阴性对照组、60，80 μg/ml各剂量组的单个细胞的平均灰度均显著高于20，40，100 μg/ml剂量组（P<0.05）。
4 讨论
子宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，约80%～95%为鳞状细胞癌，其次为腺癌或其它类型癌。自从Ru QH［2］发现TCS能引起人子宫颈腺癌细胞系HeLa细胞凋亡以来，有学者［4～6］对TCS引起HeLa细胞的凋亡机制进行了较为深入的探讨。发现TCS处理可以引起 HeLa细胞中多个基因的表达改变，其中Bcl-2蛋白表达减少、Bax蛋白增多和CREB蛋白的磷酸化；实验还显示TCS引起HeLa细胞凋亡与抑癌基因的去甲基化有关。但文献对发病率较高的子宫颈鳞状细胞癌的报告很少［7］，目前认为，TCS能抑制体外子宫颈鳞状细胞癌Caski细胞的生长，该过程可能与对OPCML、DAPK基因的去甲基化作用有关。本实验研究了TCS在体外对人子宫颈鳞癌Caski细胞的生长影响，通过吖啶橙荧光染色、TUNEL法和透射电镜等多种方法检测了细胞凋亡。结果显示，多种浓度的TCS均能诱导子宫颈鳞癌Caski细胞凋亡。
在研究TCS作用于HeLa细胞量效关系时发现，HeLa细胞的凋亡比例与TCS具有剂量依赖性［8］。为了进一步开发TCS抗宫颈癌的潜在价值，为临床治疗提供更细致的客观数据，本研究进一步研究了TCS作用于子宫颈鳞癌Caski细胞的量-效关系。结果表明，TCS的剂量从20 μg/ml到60 μg/ml，随着浓度的增高，细胞凋亡数明显增加，表明药物在一定的浓度范围内，两者有一定的剂量依赖关系；剂量从60 μg/ml增高到100 μg/ml，对凋亡的影响越来越小；剂量为60 μg/ml时，凋亡最明显。该实验将为TCS在抗宫颈癌的临床应用提供一定的实验依据。
