1.4 氧化低密度脂蛋白（OX-LDL）的制备［6,7］
将LDL置于恒温37℃、pH 7.2的PBS溶液（CuSO4，10 μmol·L-1）透析24 h，在含0.1 % EDTA的PBS中透析24 h终止反应，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌备用。脂蛋白氧化修饰程度以硫代巴比妥酸反应物质值来表示。结果OX-LDL为 21.4 μmol·L-1，LDL为 2 .2 μmol·L-1，说明LDL被氧化。
1.5 动物分组共分6组，即：对照组（control group,CG）；OX-LDL组（OX-LDL group,OLG）；肝素组（100 mg·L-1,heparin group,HPG）；IPM 100，200，400 mg·L-1保护组（IPM-100,200,400）。取细胞计数为1×108个细胞·L-1的备用传代培养细胞，按每孔500μl 接种于6孔板，每组5孔，12 h细胞融合后，更换无血清无酚红DMEN培养液，后4组（HPG和IPM-100,200,400）分别加入相应浓度的肝素和IPM预处理，培养12 h后，除CG外，其余各组分别加入50 mg·L-1OX- LDL培养 24h 获细胞。
1.6 LDL-R表达的检测（免疫酶标记法，SABC）［6］
取细胞爬片，内源性过氧化酶以3% H2O2灭活，用羊血清封闭，加兔抗鼠LDL-R一抗，4℃，次日加山羊抗兔lgG二抗；加SABC复合物，DAB-H2O2显色。脱水、透明、封片，镜下观察，阳性物呈棕黄色。以德国欧波同VIDAs图像分析系统分析实验结果，小鼠单核巨噬细胞RAW264.7 中LDL-R相对含量以细胞平均吸光度A值表示。
1.7 LDL-R mRNA表达的检测（逆转录聚合酶链反应，RT-PCR）［7］
按Trizol试剂说明一步法提取各组细胞总RNA。取总RNA 4 μl按试剂说明逆转录合成cDNA，取2 μl加入25 μl反应体系扩增，PCR扩增条件为：94℃，5 min；94℃，45 s；52℃,45 s , 72℃，1 min, 30个循环，72℃10 min。扩增后的LDL-R上游引物：5 ' TCC ATC TTC TTC CCT ATT GC 3 '，下游引物：5 ' CAG CCC AGC TTT GCT CTA 3 '，合成360 bp片断。内参照β-肌动蛋白上游引物：5 ' TAT CCT CTC CCT CAC CCC ATC3 '，下游引物：5 ' TCA GTA ACA CTC CGC CTA CAA3 '，合成639 bp片断PCR产物。用1％琼脂糖凝胶电泳显影，结果用天方凝胶图象分析软件分析，各组LDL-R mRNA 表达差异定量用各组目的基因与内参照基因的吸光度（A）比值来表示。
1.8 统计学分析各组数据采用±s表示，配对比较采用t检验。
2 结果
2.1 IPM对RAW264.7细胞LDL-R mRNA
表达的影响各组细胞均有LDL-R mRNA 表达，OX-IDL与小鼠单核巨噬细胞RAW264.7作用24h后，能明显降低LDL-R的mRNA表达，与CG比较，有显著性差异（P<0.01）；IPM-100,200,400 mg·L-1均能提高LDL-R mRNA的表达，且呈现浓度依赖趋势，以IPM-400 mg·L-1作用最强，与IPM-100和200 mg·L-1对比有显著性差异（P<0.05或P<0.01）.结果见图1及表1。表1 IPM对RAW264.7细胞LDL-R mRNA表达的影响（略）
2.2 IPM对RAW264.7细胞LDL-R蛋白表达的影响LDL-R免疫组化结果显示，各组细胞均有LDL-R表达，表达强弱有明显差别；OX-LDL与 RAW264.7细胞作用24 h后能显著降低 LDL-R蛋白表达，与CG比较有显著差异（P<0.01）；IPM对OX -LDL引起的LDL-R表达下调均有保护作用，以400 mg·L-1组作用最强，与IPM-100和200 mg·L-1对比有显著性差异（P<0.01）；肝素（100 mg·L-1）对OX-LDL引起的LDL-R表达下调无明显作用，与CG相比无显著差异（P>0.05）。结果见表2。表2 IPM对RAW264.7细胞LDL-R 蛋白表达的影响（略）
3 讨论
动脉粥样硬化（AS）是心脑血管疾病的主要病理基础，其主要成因与脂质代谢紊乱有关［8］。流行病学及实验研究发现，血浆低密度脂蛋白（LDL）浓度与AS的发生呈正相关［9］。最新研究发现，LDL受体（LDL-R）对调节体内的胆固醇平衡，降低血浆LDL浓度起关键性作用，因而LDL-R功能的缺陷和异常是引起脂质代谢紊乱主要原因［10］。LDL-R是一种细胞表面糖蛋自，能与血浆中两种致AS脂蛋白（LDL和VLDL）结合，介导内吞和胞内分解，所以LDL-R对调节血浆总胆固醇（TC ) 含量起着关键作用［11］。因此，通过调控LDL-R的活性控制高脂血症，可以预防AS的发生与发展［9］。LDL-R基因表达调控的分子机制是：转录水平LDL-R基因启动子的激活和抑制、胆固醇类分子的负反馈抑制以及转录后mRNA分子稳定性的提高与降低［10］。LDL-R 基因转录的调控主要由胞内胆固醇（负反馈抑制性机制）和非胆固醇分子介导，前者涉及胆固醇调节元件结合蛋白（SREBP1和SREBP2）的合成及与LDL - R基因启动子胆固醇调节元件（SRE1）的结合［11］。当胆固醇浓度降低时，SREBP便结合到SRE1上，激活LDL-R基因转录，这一机制对于保持细胞的胆固醇平衡有重要意义［10］。非胆固醇介导的调控机制则通过蛋白激酶MEK/ERK信号转导进行，并与LDL-R基因启动子中的重复序列3有关［9］。
