作者：付强 钱冬萌 闫志勇 侯伟 王斌
【摘要】 目的 在大肠杆菌中表达人IL21编码基因，并进行蛋白纯化和抗原性分析。方法 以经PHA刺激的人扁桃体细胞cDNA 文库为模板，经PCR获得IL21全基因片段。测序确认后，分别设计含BamHⅠ和SalⅠ酶切位点的引物，经PCR获得IL21成熟肽的编码基因。将此IL21基因插入表达载体pGEX4T2，重组克隆经酶切与测序确认后转化大肠杆菌DH5α,进行IPTG诱导表达。经琼脂糖珠结合的纯化方法所得产物用Western Blotting作抗原性分析。结果 SDSPAGE显示经IPTG诱导后的大肠杆菌DH5α表达与理论相符的条带，并获得了与理论值相符的纯化条带，在进一步的Western Blotting分析中发现表达的蛋白能与IL2的单抗产生结合反应。结论 人IL21编码基因克隆载体在大肠杆菌中成功表达，同时建立了该蛋白的琼脂糖珠纯化方法，通过免疫印迹实验揭示了原核表达的IL21蛋白与IL2之间结构的相似性。
【关键词】 白细胞介素21; 基因表达;免疫印迹法；重组融合蛋白质类
［ABSTRACT］ObjectiveTo express coding gene of human interleukin21 (IL21) in E.coli, purify its protein, and assay its antigenicity.MethodsHuman IL21 gene fragments were obtained from human tonsil cDNA by PCR. The coding gene for the mature N terminus of IL21 was inserted into prokaryotic expressing vector pGEX4T2 and transformed into E.coli DH5α. The expressed product was purified by affinity chromatography using GST Fusion Protein Purification bead and its antigenicity analyzed by Western Blotting.ResultsInduced by IPTG, E.coli DH5α expressed the right molecular weight protein. Western Blotting test showed the protein had reaction with IL2 monoclonal antibody.ConclusionThe vector pGEX4T2/IL21 and engineering bacteria E.coli DH5α expressing IL21 mature N terminus fusion protein is successfully constructed. By purification and Western Blotting test, the recombinant IL21 revealed resemblant antigenicity to IL2.
［KEY WORDS］Interleukin21; Gene expression; Immunoblotting; Recombinant fusion proteins
以美国JULIA教授为首的研究小组在国际上首次构建了BaF3/IL21R细胞系，并用此细胞系从活化的CD+3细胞中分离并鉴定了一类新的细胞因子——人白细胞介素21（IL21）[1]，此后世界范围多个实验室相继进行了相关研究。现在已知IL21具有广泛的生物学功能，能够调节体液和细胞介导的免疫应答，刺激T、B和NK细胞的增殖、活化和分化，并且对肿瘤细胞的生长有抑制作用[2～4]。本研究构建了中国人IL21基因编码的重组质粒，并在大肠杆菌中进行表达[5]。同时通过进一步对表达产物进行GST亲和层析纯化后，使用IL2单克隆抗体与重组蛋白做Western Blotting抗原性分析。现将结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 质粒、菌株和主要试剂
质粒pGEX4T2和菌株E.coli JM109、E.coli DH5α均为本室保存。PCR试剂、T4 DNA连接酶、PCR产物纯化试剂盒、pGEMT Easy Vector 试剂盒均购自Promega公司。DNA限制性内切酶BamH Ⅰ、Sal Ⅰ 均购自Takara公司。引物均由北京赛百盛公司合成(PAGE纯化)，GST Fusion Protein Purification bead 购自Amersham公司。
1.2 IL21全编码基因的克隆
将经PHA刺激培养48 h的人扁桃体细胞总RNA逆转录为cDNA后，进行PCR扩增。利用T4 DNA连接酶将7.5 μL PCR纯化产物与0.5 μL TEasy载体连接。同时，使用TSS法制备感受态大肠杆菌JM109，将连接产物转化后在涂有XGal和IPTG的ALB固体培养基上培养,37 ℃放置12～16 h。 通过蓝白斑法选择阴性、阳性克隆，从中提取重组质粒DNA，采用 PCR和酶切初步鉴定后，进行DNA序列测定分析。
