Hedgehog信号转导通路下游转录因子Gli1在人神经胶
质瘤中对水通道蛋白AQP1调控作用的研究
第二军医大学 博士学位论文
Hedgehog信号转导通路下游转录因子Gli1在人神经胶质瘤中对 水通道蛋白AQP1调控作用的研究 姓名杨朝旭 申请学位级别博士 专业生物化学与分子生物学 指导教师王红阳 20090501
在人胶质瘤中对水通道蛋白调控作用的研究 第一部分 摘要
信号转导通路下游转录因子在人神经胶质瘤中对水通 道蛋白调控作用的研究 研究背景和目的
信号转导通路是在脊椎动物的中枢神经系统发育中起至关
重要作用的一条信号通路其在胚胎早期可以通过通路各组分不同时间空间的
特异性表达对多种细胞的命运决定产生影响并且可以与等
信号通路产生相互作用来实现不同细胞定向分化的精细调节信号的 调节紊乱在胚胎期会造成神经系统的发育障碍和畸形在已经成熟的个体则会导
致肿瘤的发生 最初是在研究神经胶质瘤时发现并命名的一个基因其编码的蛋白是信号途径最重
要的下游转录因子之一也是信号最终的响应者和功能的执行者
信号通路在神经胶质瘤中处于一种调节紊乱的异常激活状态在胶质瘤的发生发
展中起着重要作用其上游配体信号的存在对于胶质瘤的生长及肿瘤干细胞 的自我更新能力的维持有着重要作用其下游转录因子可以通过调节 的表达水平参与胶质瘤细胞的增殖和凋亡同时也与胶质瘤的恶 性程度和恶性生物学行为的维持密切相关 水通道蛋白是类分布在细胞膜表面能够特异的对
水分子进行快速高效跨膜转运的小分子通道蛋白家族在中枢神经系统中主要分
布的水通道蛋白是近年来的研究发现与神经系统的一些疾病尤其 是肿瘤性疾病的进展有着密切的关系在胶质瘤细胞向周围组织的侵袭生 长及瘤周组织的脑水肿形成方面都发挥了重要的作用虽然已经有大量的研究阐
明了是如何通过自身的通道结构对水分子进行跨膜转运的但是对其本身 表达水平的高低受何种机制的调控尤其是它与主要信号通路之间的关系仍
然知
之甚少第二军医大学博士学位论文
本研究拟从一种中枢神经系统最常见的肿瘤神经胶质瘤入手研究 通路的异常激活与水通道蛋白之间的关系旨在证明
通路下游转录因子对的表达具有调控作用阐明这种调控是在何种
水平以何种方式进行并对这种调控作用对神经胶质瘤细胞恶性生物学行为产
生的影响进行了初步探讨 实验方法
用免疫组织化学免疫荧光共定位实验和 等方法研究神经 胶质瘤标本中通路的激活情况以及的表达情况并对 两者之间的相关程度进行分析
构建包含启动子区全长的报告基因质粒一
将与报告质粒共转细胞荧光素酶报告基因系统检测对 激活程度的影响
将过表达质粒瞬转细胞收获不同时间点及不同转入剂量的样品 观察转录水平
观察蛋白水平的表达变化
设计合成基因特异的干扰片段构建干扰载体体外验证有效后 研究干扰掉后对报告基因活性及胶质瘤细胞系中表达 的影响
建立分别稳定转染空载体过表达及稳定干扰的三种神经胶 质瘤细胞系一 方法检
测三种细胞系中表达水平的变化
将报告质粒转入三种不同的稳定细胞系中检测转录活性的变化 分析启动子区根据的核心结合序列设计引物运用染色质 免疫共沉淀技术研究与启动子区的结合情况 根据实验结果利用重叠延伸技术构建启动子区突变
报告基因质粒转入相应的稳定细胞系中利用报告基因检测确定在 对调控中起关键作用的启动子区段位置阐明调控作用的机 带
在人胶质瘤中对水通道蛋白调控作用的研究 利用和
实验比较不同细胞系侵袭能力的
差异评价在胶质瘤细胞系中调控表达所引起的生物学功能 变化 实验结果
神经胶质瘤组织标本中和的表达与对照正常组织相比都呈现 出异常高表达的状态并且两者之间的高表达具有特异的相关性 外源瞬时转入及稳定表达都可以在转录和翻译水平上调的表 达并能显著增强含有启动子区全长的报告基因的活性 特异性干扰的表达则可以降低的表达并抑制的报告基 因活性
可以和启动子区中的保守调节序列相结合其中启动 子区位的保守结合序列对维持的调节作用至关重要
表达水平不同的神经胶质瘤细胞系表现出不同的侵袭转移能力在 侵袭能力较低的细胞系中外源性转入可以使其侵袭能力得到恢复 提高提示神经胶质瘤中可能通过上调的表达来增强肿瘤细 胞的恶性生物学特性 结论
本研究首次发现了神经胶质瘤中通路异常活化与异常高表 达两种现象之间的关系并且证实通路下游转录因子可以通过与 启动子区的结合在转录和翻译水平对其表达进行调控其中启动子区 一一一段的序列在这一调控作用中发挥重要作用在胶质瘤细胞中 这一调控作用的生物学意义是可以通过上调来增强胶质瘤细胞的恶 性侵袭能力
关键词信号通路神经胶质瘤转录调节 在人胶质瘤中对水通道蛋白调控作用的研究 第二部分 摘要
基于结构修饰的靶向通路小分子抑制剂的 筛选研究 研究背景和目的
信号转导通路通路是一条高度保守的在生物的胚胎发育
及多种疾病的发生发展过程中起重要作用的信号通路近年来的研究表明在
