关于全基因组关联分析工具Plink的操作使用说明
Plink是一个开放的，免费的全基因组关联分析工具。其分析的基础是基因型和表型数据。通过整合gplink 和Haploview 使得结果变得可视化。 gplink 是基于Java的图形用户界面，许多plink 命令可以通过其实现。而且易于与Haploview进行整合。Haploview是一个进行单倍型分析的一个软件。因此，我们在做关联分析以前需要准备好以上软件的安装。 具体的分析步骤可以分为两大部分。
第一部分
下面我将依据一个具体的分析实例，对 plink的使用加以说明。
1；首先是数据的准备
Plink 程序识别两种文件格式，(.PED),(.MAP) 两种格式文件。在具体的文件里面又限制了具体的格式要求，
对于(.PED) 文件，文件的前六列是强制的格式，依次为： Family ID Individual ID Paternal ID Maternal ID
Sex (1=male; 2=female; other=unknown) Phenotype
在我们的研究过程中，第七项一般是基因型。（以后我们的数据形式） 对于(.MAP)文件，包括一下的四项：
chromosome (1-22, X, Y or 0 if unplaced) rs# or snp identifier
Genetic distance (morgans) Base-pair position (bp units) 由于Plink程序识别的是二进制文件，所以我们要通过相应的命令将其转化成二进制的。命令如下：
plink --file wgas1 --make-bed --out wgas2
2；在完成数据的准备后，下面就是对于数据的过滤过程，也称作质量控制，一般我们需要考虑的因素是个人基因型缺失率，位点基因型缺失率，哈迪温波格平衡，从而提取SNP，通过以上的限定条件，我们得到分析后的数据，命令如下; plink --bfile wgas2 --out validate plink --bfile wgas2 --freq --out freq1 plink --bfile wgas2 --hardy --out hwe1
plink --bfile wgas2 --maf 0.01 --geno 0.05 --mind 0.05 --hwe 1e-3 --make-bed --out wgas3
3;做一些基本的关联分析，命令如下：
plink --bfile wgas3 --assoc --adjust --out assoc1
该关联分析使用的方法是Basic allelic test chi-square (1df)，然后进行显著性水平调解，从而选择出与疾病关联的治病基因。
4；基于人群分层的关联研究
plink --bfile wgas3 --mh --within pop.cov --adjust --out cmh1
主要是输出的显著性水平调解，使用的方法是CM，选出显著性水平值最小的，说明越显著。（结果是按顺序输出的）。研究实例中提供了一个人群分层的文件 pop.cov ,在实际操作中是要通过聚类分析进行分类后才得到的。具体的关于人群分层的命令，在第二部分会提到。
以上的关联研究，称为第一部分。主要是通过分析找出治病相关的SNP.
第二部分
5；部分的工作主要是寻找单体型，并进行分析，从而找出真正的治病关联基因。 通过第一部分的研究，我们找出了一个snp rs11204005, 我们需要建立一个新的关于snp rs11204005文件，从而单纯的对其进行分析。首先是从原始文件中将其提取，然后对其等位 基因频率，哈迪温伯格平衡进行检验，命令如下： plink --bfile wgas3 --recode --snp rs11204005 --out tophit plink --file tophit --all --missing plink --file tophit –hardy
以上我们进行了MH（一种假设检验的方法）的关联分析，下面进行重复性分析，命令如下（主要是基于相关变量的分析，如表型，基因异质性等）
plink --file tophit --mh --within pop.cov –bd（使用一种新的检验方法） plink --file tophit --homog --within pop.cov（基于纯合子的研究）
plink --file tophit --logistic --covar pop.cov –interaction （将人群分层作为变量，进行逻辑回归） plink --file tophit --assoc --pheno pop.cov（将人群分层作为表型，进行关联分析）
plink --file tophit --logistic --pheno pop.cov --covar tophit.ped --covar-number 4（指定变量文件，选择具体的变量进行分析，这里 number 4在文件属于表型，实质本命令可以看作以上命令综合）
下一步进行基因型与疾病之间的关联分析： plink --file tophit --model --cell 1
plink --file tophit --logistic --genotypic
plink --file tophit --logistic --genotypic –hethom 探讨性别与疾病的关联分析，命令如下 plink --file tophit --filter-males --logistic plink --file tophit --filter-females --logistic plink --file tophit --logistic --sex –interaction
依据经验进行人群分层：
plink --bfile wgas3 --indep-pairwise 50 10 0.2 --out prune1
plink --bfile wgas3 --extract prune1.prune.in --genome --out ibs1
plink --bfile wgas3 --read-genome ibs1.genome --cluster --ppc 1e-3 --cc --mds-plot 2 --out strat1
下面我们需要做的是建立一个新的文件，以便于寻找单体型，主要操作步骤就是在寻找到的治病基因SNP 周围选择一定的基因序列，重新进行分析。
plink --bfile wgas3 --snp rs11204005 --window 100 --merge extra.ped extra.map --make-bed --out followup
plink --bfile followup --mh --within pop.cov --out followup-cmh
plink --bfile followup --clump followup-cmh.cmh --clump-verbose --clump-r2 0.1
--clump-annotate OR,A1
plink --bfile followup --recodeHV --out hv1
plink --bfile followup --snps rs2460915,rs7835221,rs2460911,rs11204005,rs2460338 --make-bed --out followup2
plink --bfile followup2 --r2
对通过以上分析选出的单体型，进行分析，选出真正的治病基因，命令如下： plink --bfile followup2 --chap --hap-snps rs2460915-rs2460338 --each-versus-others
plink --bfile followup2 --chap --hap-snps rs2460915-rs2460338 --independent-effect rs2460915 证明SNP在独立于单体型之外所发挥的作用
plink --bfile followup2 --chap --hap-snps rs2460915-rs2460338 --independent-effect rs7835221 plink --bfile followup2 --chap --hap-snps rs2460915-rs2460338 --independent-effect rs2460911 plink --bfile followup2 --chap --hap-snps rs2460915-rs2460338 --independent-effect rs11204005 plink --bfile followup2 --chap --hap-snps rs2460915-rs2460338 --independent-effect rs2460338 是否存在SNP决定整个单体型的影响
plink --bfile followup2 --chap --hap-snps rs2460915-rs2460338 --control rs2460915 plink --bfile followup2 --chap --hap-snps rs2460915-rs2460338 --control rs7835221 plink --bfile followup2 --chap --hap-snps rs2460915-rs2460338 --control rs2460911 plink --bfile followup2 --chap --hap-snps rs2460915-rs2460338 --control rs11204005 plink --bfile followup2 --chap --hap-snps rs2460915-rs2460338 --control rs2460338
以上大概讲述了，操作中的命令的目的。细节的操作，以及相关命令的参数设置，命令中涉及到的原理，这些问题是我下一阶段要解决的问题。另外，Plink还不单单涉及到是基于随机人群的case-cntorl 研究，还有基于家系的研究。下一步是探求具体的plink 所涉及的知识点原理。
以上是我对plink的认知介绍，其中大部分是个人理解，希望韩老师，批评指证。
