【内参（基因/蛋白）的背景知识】 Western Blot实验常用于检测蛋白表达量、蛋白表达产物的正确性等。相对于其他检测蛋白的方法而言Western Blot实验在蛋白的定性定量分析、与“目的蛋白”量的比较方面更简单一些。
在定量分析时，为排除各样本蛋白总量不同的干扰，WB的每个样本的“上样量”（并不仅仅指上样量的体积）即对应泳道的蛋白总量应该均一。因此需提前对各蛋白样本进行定量，使得各样本的蛋白浓度一致，如此WB时，当每泳道上样体积一致时，则对应的蛋白总量也一致。
作为Control，应选择能在各个细胞都能稳定表达的内参基因（常见的内参
基因有β-Actin，GAPDH等，具体需参考文献），如WB的结果显示内参基因
一致，则表明本次实验各泳道的蛋白总量一致，实验也就具备了分析的前提和基础。
内参即是内部参照(Internal Control)，对于哺乳动物细胞表达来说一
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般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在Western Blotting实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。
虽然，顺利的时候Western Blot做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果、假阳性、结果出现多条带、到底是一抗有问题还是二抗有问题……毕竟，作为一种有活性的生物大分子，抗体和抗原的反应不像“1+1”那么明确，而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物，确实是有一定的不确定性。所以，严谨的 Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果的分析非常有用。特别是当实验出现问题时，借助参照体系很容易就可以查出问题所在，而不必抓耳挠腮，怨天尤人。
良好的参照体系通常包括分子量Marker(用来确定蛋白条带对应的分子量大小)、空白载体对照(如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照)、已知量标准产物的正对照，另外还有内参。可是由于经费限制或者偷懒的原因，国内的不少人做Western Blot往往省略参照，导致结果出现问题时无法分析结果，即便有结果也可能影响结果的分析。
实际上内参是最容易被忽略的一项。我们知道，要用Western Blot 比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础，特别表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析，所以需要内参。在国外发表的文章中，Western Blotting 实验结果须进行内参校正已成为一种惯例。但是，国内仍有不少科研人员在Western Blotting实验中忽略了内参的使用，将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种样品间上样量等同的唯一方法。
然而各种蛋白质浓度定量方法，都存在局限性，不能完全准确的确定各种样品的蛋白浓度。
如UV法直接定量，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质，相对于比色法来说，操作简单，但是容易受到平行物质如DNA的干扰，且敏感度低，要求蛋白的浓度较高。
比色法测定蛋白浓度一般有BCA、Bradford、Lowry 等几种方法。BCA法与Lowry法都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。Bradford法敏感
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度最高，且与一系列干扰Lowry、BCA 反应的还原剂(如DTT，巯基乙醇)相容，但是对去污剂依然是敏感的，其最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。另外，蛋白质定量以后进行电泳时需要等量上样，此步骤也存在操作误差。在Western blotting实验时使用内参，即可简便地对定量和上样步骤产生的误差进行校正。
在Western Blot中使用内参其实就是在WB过程中另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。
在Western Blotting实验过程中使用内参的方法通常有以下三种：
（1）第一种是超级简便的标记内参使用法，只要在二抗孵育时加入HRP标记内参抗体，按照正常操作即可;
（2）第二种是普通内参，当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时，可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测，然后使用Strip缓冲液洗掉膜上的抗体，重新进行内参蛋白的抗体温育、显色检测。 （3）第三种（最常用），当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下，可以在转膜后预染，根据蛋白质Marker的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分，使内参蛋白与目的蛋白分开，然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行孵育，二抗孵育以及显色。
常用的蛋白质内参有GAPDH甘油醛-3-磷酸脱氢酶
(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。一般我们选择内参与要检测的目的蛋白的分子量最好相差10kDa以上。因此你要知道你检测的蛋白的分子量来选择合适的内参。
【β-Actin、GAPDH、Tubulin的具体应用】 actin即肌动蛋白，是细胞的一种重要骨架蛋白。
Actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，包括alpha-skeletal muscle actin、alpha-cardiac muscle actin、alpha-smooth muscle actin和gamma-smooth muscle actin，其余两种广泛分布于各种组织中，包
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括beta-actin (β- non-muscle) 和gamma-non-muscle actin。
这些不同的亚型组织分布是不一样的，在肌肉组织中的beta-actin分布就很少，心肌主要是alpha-cardiac muscle actin。因此不同的组织本来就应该选择不同的内参，不能一概而论的。
Beta-actin作为内参是得到了公认的，这是针对大多数组织和细胞来说的，它广泛分布于细胞浆内，表达量非常丰富。尽管最近有一些文章已经开始质疑beta-actin作为内参的有效性(疑似对于上样量>20μg的蛋白区分能力下降)，但是发文章应该还是没有问题的。
