沙蚕激酶全基因在大肠杆菌中表达及溶栓作用检测(2)

    1.2.2  目的蛋白的表达及纯化  将上述已测序的包含目的克隆的菌株接种到ALB（含氨苄青霉素50 mg/L）平板复苏，次日挑取单个转化菌菌落，接种于ALB培养液5 mL中，37 ℃培养过夜，次日取培养物按1∶100比例接种于新鲜ALB培养液中，37 ℃振荡培养至A600约1.0，加IPTG至1 mmol/L，置37 ℃诱导培养3 h，收集菌体。将菌体用PBS（pH 7.3）洗涤2次，超声处理（每次15 s，共3次），分别收集上清，将上清中加入GST fusion protein purification beads振荡30 min纯化浓缩上清中的蛋白，进行SDS-PAGE检测。同时，将浓缩纯化后的上清蛋白加凝血酶22 ℃酶切8~14 h,得到纯化的目的蛋白。
    1.3  沙蚕激酶溶栓检测
    1.3.1  分组及给药设计  将SD大鼠40只随机分为5组：生理盐水对照组，沙蚕激酶粗提物低剂量组(93.75 mg/kg)、中剂量组（187.50 mg/kg）、高剂量组(375.00 mg/kg)，蚓激酶阳性对照组(3 750 U/kg),以上各组均十二指肠注射给药。
    1.3.2  动-静脉旁路血栓模型制备  将SD大鼠用80 g/L水合氯醛按500 mg/kg剂量腹腔注射麻醉，背位固定，分离左侧颈外静脉和右侧颈总动脉。在三段聚乙烯管中段放入一段长6 cm的4号手术丝线，聚乙烯管内充满肝素生理盐水溶液(5×104 U/L)。用聚乙烯管的一端插入左颈外静脉后，由聚乙烯管准确注入肝素生理盐水溶液(50 U/kg)抗凝，然后再将聚乙烯管的另一端插入右颈总动脉，打开动脉夹，血液从右颈总动脉流至聚乙烯管内，返回左颈外静脉，形成颈动-静脉旁路。
    1.3.3  血栓湿质量的测定  制作动-静脉旁路血栓模型后，十二指肠注射给药,0.5 h后，腹主动脉取血，阻断右颈总动脉和左颈外静脉血流，迅速取下聚乙烯管，取出手术线，放在滤纸上用电子天平测定质量，以总质量减去线质量，即血栓湿质量。
    1.3.4  优球蛋白溶解时间（ELT）测定  取9份全血与1份38 g/L枸橼酸钠溶液混合，然后立即以3 000 r/min离心10 min，分离出无血小板血浆。取血浆0.5 mL，加9.0 mL蒸馏水，再加体积分数为0.01的醋酸溶液0.1 mL,使pH值为4.5，充分混合后，将混合液置于4 ℃冰箱内10 min，使优球蛋白沉淀，再以3 000 r/min离心5 min,弃去上清液，将沉淀管倒置滤纸上吸去多余液体。加入硼砂缓冲液（pH=9）0.5 mL于离心管中，用玻璃棒搅匀约1 min。将试管置于37 ℃水浴中，2 min之后加入0.025 mol/L的CaCl2溶液0.5 mL，使其凝固，形成优球蛋白凝块，开始记录优球蛋白凝块完全溶解成水溶液的时间。
    1.3.5  血浆FIB的检测  利用SINNOWA D-360全自动生化分析仪对血浆中FIB含量进行检测。
    1.4  统计学处理
    应用SPSS 11.0软件包处理，组间比较采用方差分析。
    2  结    果
    2.1  重组表达载体的鉴定
    采用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切重组表达载体pGEX4T-2-沙蚕激酶基因，同时以P1和P2为引物进行PCR和酶切鉴定，在249 bp处均出现一条明显的条带，与测序结果提供的碱基数一致。见图1。
    2.2  沙蚕激酶蛋白电泳检测
    沙蚕激酶相对分子质量约9 000，GST蛋白相对分子质量为26 000，因此二者形成的融合蛋白相对分子质量为35 000。图2中所示蛋白条带与之相符合，说明沙蚕激酶基因已经正常表达。

    2.3  溶栓检测结果
    与生理盐水对照组比，沙蚕激酶粗提物可使血栓质量明显减小，且呈现剂量依赖关系，其中高剂量组作用明显强于低、中剂量组和蚓激酶阳性对照组(F=19.112,P<0.05)；与生理盐水对照组相比较，沙蚕激酶粗提物可缩短ELT,呈现剂量依赖关系，其中高剂量组、中剂量组作用明显强于蚓激酶阳性对照组(F=20.390,P<0.05)；但沙蚕激酶粗提物对血浆FIB含量无明显影响(F=1.333，P>0.05)。见表1。表1  沙蚕激酶粗提物对大鼠血栓湿质量、ELT和FIB含量的影响