姜黄素对雄激素非依赖性前列腺癌PC3细胞凋亡影响(2)

2025-04-30

    1.2       实验方法
    1.2.1       细胞培养       人前列腺癌细胞PC3于含体积分数0.10的胎牛血清、100 kU/L 青霉素、链霉素的RPMI 1640培养液中，在37 ℃含体积分数0.05的CO2培养箱中培养，每2～3 d传代1次。
    1.2.2       CCK8 法检测细胞生长抑制率       将处于对数生长期的PC3细胞用2.5 g/L的胰蛋白酶消化，使其成为单细胞悬液。血细胞计数板上计数，调整细胞密度为5×108/L，分别以每孔100 μL接种于96孔板，继续培养24 h。细胞贴壁后分别加入姜黄素溶液使终浓度分别为10、20、30、40 μmol/L，以不加药物为对照组，RPMI 1640为阴性对照组，每组设6个复孔。于24 h后，每孔加10 μL的CCK8，设置空白对照孔，CO2孵箱中继续孵育0.5～4.0 h，测450 nm处吸光度(A)计算细胞存活率。肿瘤细胞存活率= (用药组A值/对照组A值)×100%。
    1.2.3       Hoechst染色观察细胞形态学变化       细胞经消化计数后接种于盛有盖玻片的6孔板，密度为5×107／L，过夜，使盖玻片长满的细胞约为50%～80%。用终浓度为0、5、10、20 μmol/L姜黄素刺激细胞48 h后，吸尽培养液，加入0.5 mL固定液固定10 min。去固定液，用PBS洗2次（用摇床轻轻晃动），每次3 min，吸尽液体。加入Hoechst 33258染色液0.5 mL，染色5 min，轻轻晃动。用PBS洗2次，每次3 min。滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，尽量避免出现气泡。荧光显微镜下观察蓝色细胞核的形态。
    1.2.4       Annexin V/PI检测细胞凋亡率       选用5、10、20 μmol/L浓度的姜黄素处理PC3细胞，48 h后，将培养瓶内的细胞用4 ℃预冷的PBS洗2次，用250 μL结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其密度为1×109/L。将100 μL细胞悬液加入5 mL流式管中，与5 μL的Annexin V/FITC和体积分数0.02碘化丙锭溶液10 mL混合，室温避光孵育15 min，在反应管中加400 μL的PBS，使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。
    1.3       统计学分析
    应用SPSS 10.0及PPMS 1.5[3]统计软件进行统计学处理，各指标比较采用方差分析，组间比较采用q检验。
    2       结果
    2.1       姜黄素作用PC3细胞后体外存活率变化
    0、10、20、30、40 μmol/L浓度的姜黄素处理细胞48 h后，细胞存活率分别为（97.66±3.12）%、（86.98±3.32）%、（65.84±2.78）%、（53.85±2.74）%、（32.37±3.04）%，不同浓度姜黄素组之间细胞存活率比较差异均有显著性，且呈浓度依赖性 (F=36.82，q=4.879～15.36,P<0.01）。
    2.2       姜黄素对细胞凋亡形态影响
    经不同浓度的姜黄素作用PC3细胞48 h后，空白对照组的细胞核均匀着色，呈弥散状蓝色荧光，少有异常核(图1a)； 10 μmol/L姜黄素组出现少量早期凋亡细胞(图1b)；20 μmol/L 姜黄素组细胞出现典型的凋亡形态学变化，镜下可见染色质凝集、核固缩、核碎裂等形态学改变(图1c)。

2.3 不同浓度的姜黄素作用PC3细胞后细胞凋亡率的变化
选用0、5、10、20 μmol/L的姜黄素处理PC3细胞48 h后，其凋亡率分别为（1.55±4.12）%、（4.94±3.46）%、（8.48±3.78）%、（12.47±3.55）%。除0与5 μmol/L姜黄素组细胞凋亡率没有显著差异外，其他组之间比较差异均有显著性（F=7.88,q=4.15～6.54,P<0.05）。

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