ND308抗脑缺血神经保护作用的研究(2)

2025-04-30

　　通讯作者：梁绪国，Email:liangxuguo@yahoo.com.cn 化合物ND308为丹参酚酸B在脑内的降解产物，说明该化合物能够透过血脑屏障。我们前期研究发现ND308对缺糖缺氧致培养大鼠神经元损伤有显著的保护作用，现在我们利用大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型，观察ND308对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用，并探讨其作用机制。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验动物清洁级雄性Spragua Dawlay大鼠(合格证号：20030020)，体重250～300 g，山东绿叶制药股份有限公司实验动物中心提供。
　　1.2 试验药物 ND308：由山东省天然药物工程技术研究中心提供，纯度99%以上，批号：061250。依达拉奉注射液: 江苏先声药业生产，规格10 mg/5 ml，批号80041101。
　　1.3 试剂氯化三苯四氮唑(TTC)：Sigma公司，UltraSensitiveTMSP免疫组化染色试剂盒、多聚赖氨酸(PolyLLysine)、DAB显色试剂盒、柠檬酸盐组织抗原修复液：福州迈新生物技术开发有限公司;兔抗大鼠IL1β、TNFα、NFκB抗体：北京博奥森生物技术有限公司，其余试剂均为国产分析纯。
　　1.4 方法
　　1.4.1 采用改良Longa法制作MCAO模型[4]，大鼠用10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔注射麻醉后，仰卧固定，颈部皮肤用碘伏消毒;颈部正中切开，钝性分离右侧颈总动脉(CCA)，颈外动脉(ECA)，颈内动脉(ICA),并沿ICA向下分离翼腭动脉(PPA)，结扎PPA、ECA及CCA近心端，于远心端备线，在CCA近分叉处剪一“V”形切口，将直径为0.24 mm的尼龙线光滑头端自切口处轻轻插入，经分叉处进入颈内动脉(CIA)，继续向前推进，遇有轻微阻力感，表明尼龙线头端已进入大脑中动脉并阻断血流，平均插入深度约为(1.8±0.5)cm, 固定尼龙线，记时。逐层缝合，尼龙线留约1 cm于皮外;缺血2 h后，将尼龙线轻轻抽出，使栓线头端在CCA内。此时依靠对侧脑血流通过大脑动脉交通支实现右侧脑组织血流再灌注，再灌24 h。假手术组只进行麻醉和血管分离术，不导入栓线。待动物清醒后，观察神经系统症状以判断手术是否成功，将手术成功大鼠随机分为6组：模型组、假手术组、ND308小剂量组(5 mg/kg)、ND308中剂量组(10 mg/kg)、ND308大剂量组(20 mg/kg)，阳性对照依达拉奉组(6 mg/kg)。于再灌注30 min内经尾静脉注射给药，模型组与假手术组给予相同体积的生理盐水，持续缺血2 h再灌注24 h后处死动物。
　　1.4.2 于再灌注24 h末，由一位不了解分组情况的观察者按照Longa法[5]五分制评分标准对大鼠进行神经行为障碍评分，0分：无神经功能缺损症状;1分: 不能完全伸展对侧前肢;2分: 行走时向对侧旋转，出现“追尾”现象;3分: 站立不稳，向对侧倾倒;4分: 不能自发行走，意识障碍。
　　1.4.3 脑梗死体积测定采用TTC(氯化2,3,5-三苯基四氮唑)染色方法，大鼠处死后，迅速取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，在冰盘上连续冠状均匀切取5片，置入2%TTC染液中37℃恒温孵育20 min，用数码相机拍照，应用Champion ImageHPIAS1000高清晰度彩色病理图文报告分析系统测出各区脑梗死体积，根据公式：梗死体积 =[左侧半球体积-(右侧半球体积-苍白区体积)]/全脑体积，算出梗死体积百分比。
　　1.4.4 石蜡切片的制备：大鼠于再灌注后24 h以10%水合氯醛腹腔注射，大鼠过量麻醉后取仰卧位，固定四肢，快速剪开胸腹腔，暴露出心脏和主动脉弓，左心室插管至主动脉，先用生理盐水约200～300 ml灌洗，后用4%多聚甲醛约300 ml先快后慢灌注固定，直至动物呈僵硬状态，眼球变白，迅速断头取脑，用生理盐水洗干净后，置4%多聚甲醛中冷藏固定6～12 h，然后取出，均于视交叉后1 mm及4 mm处冠状切面切开鼠脑，经梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制作石蜡切片(片厚4 μm)。
　　1.4.5 脑组织形态学检查：将制作好的石蜡切片，进行HE染色，光镜下观察缺血侧大脑皮层的组织形态学变化。

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