家族性及早发性乳癌病人BRCA1基因外显子2和20突变研究(2)

　　1.2.3  PCR扩增 
　　PCR反应体系及条件：总反应体系50 μL，内含DNA模板1 μg（根据DNA模板浓度添加），2×PCR TaqMix 25 μL，上下游引物（浓度均为10 μmol/L）2 μL，超纯水补足反应体积至50 μL。PCR反应参数：95 ℃预变性2 min； 94℃变性2 min， 50 ℃退火1 min， 72 ℃延伸36 s，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。
　　1.2.4  PCR产物鉴定 
　　取5 μL PCR扩增产物并加入1 μL Loading buffer，经20 g/L含有EB的琼脂糖凝胶电泳鉴定，其余的置-20 ℃保存备用。
　　1.2.5  PCR产物直接测序 
　　将PCR扩增产物各40 μL送上海生工生物工程技术有限公司进行双向测序。将所得序列测定结果同GenBank中 cDNA BRCA1（U14680）正常的基因序列进行对照，判断有无基因突变，然后再将所检测到的BRCA1突变位点与乳癌信息中心网站数据库（BIC）对照，判断是否为致病性突变位点。
　　2 结果
　　2.1 PCR扩增
    本文55例乳癌病人及20例乳腺良性肿瘤病人BRCA1基因第2和20外显子的PCR扩增产物，其在20 g/L琼脂糖凝胶中电泳检测均显示单一条带，与对照组的相应片段长度一致，结果表明，75例病人BRCA1基因在所检测的片段上没有明显的插入或缺失（图1、2）。
　　2.2 DNA测序
    本文75例病人PCR扩增产物经DNA直接测序，并将序列测定结果与GenBank中cDNA BRCA1（U14680）正常的基因序列进行对照，在外显子2和20的序列中均未发现有突变。
　　3 讨论
    1990年，HALL等［5］用连锁分析的方法发现早发性家族遗传性乳癌的发生与染色体17q21的一个基因突变有关，并将其命名为BRCA1。1994年，MIKI成功地克隆此基因，从此对BRCA1的功能、突变情况及其与乳癌、卵巢癌发生关系的研究迅速深入开展起来。BRCA1定位于染色体17q21,约占染色体组DNA的10万个碱基范围，包括22个外显子，其中最大的外显子11长度约为3.4 kb，表达7.8 kb的mRNA和1 836个氨基酸的蛋白质，相对分子质量为20万。BRCA1蛋白的氨基酸末端含有一个在许多核酸结合蛋白中发现的锌指结构，这提示BRCA1可调节基因表达。大量的实验结果表明BRCA1为一种抑癌基因, 其编码抑癌蛋白,具有DNA损伤修复、转录活化与抑制、细胞周期的调节作用、中心体复制的负性调节作用等，对肿瘤生长起负性调节作用，其突变和低表达是诱发乳癌的主要原因之一。

   到目前为止，已确定了100多种BRCA1的种系突变，包括错义突变、无意义突变、移码突变、缺失突变等，这些突变散在分布于22个编码的外显子，其中突变位点以外显子11（约45%）、外显子2（约18%）以及显子20（约9%）为多见［6］。有些突变在某种族中较为频发，但目前还未发现有普遍意义的突变热点。BRCA1突变的频率和类型与种族、地域有一定的关系。有关BRCA1突变研究资料多来源于国外，国内资料较少。本研究选择中国青岛地区家族性乳癌病人30例及早发性乳癌病人25例作为研究对象,对BRCA1中的高发突变位点第2及20外显子进行序列分析。测序结果与GenBank中的BRCAl cDNA序列（登录号u14680）比较，在外显子2和20的序列中均未发现有突变。
    ANNIKA等［7］对瑞典24例家族性乳癌-卵巢癌病人进行研究，结果显示，BRCA1的突变率为75%，其早发性乳癌（≤40岁）BRCA1的突变率为23%。CORSKI等［8］检测波兰35例家族性乳癌病人BRCA1的突变率为34.3%。而1995年INOUE等［9］对日本18个乳癌家族及2个卵巢癌家族的研究显示，仅检测到2例乳癌存在突变。新加坡学者在76例中国妇女乳癌病人中检测到6例突变，突变率为8.6%［10］。在中国有关BRCA1基因突变的报道例数不多，赖春宁等［11］检测186例散发性乳癌BRCA1的突变率为7%。均低于欧美国家。原因可能为肿瘤相关基因在不同环境、不同种族中作用程度各不相同［12］，也说明在BRCA1之外还存在其他乳癌相关基因，故尚需扩大样本和检测范围来进一步研究。