胃肠道间质瘤的ckit基因突变检测(2)

2025-04-28

    用Qiagen DNA 试剂盒提取石蜡包埋组织的DNA，行PCR扩增。所有病例均首先进行ckit 第11号外显子的扩增检测，发现有突变者，不再进行其他突变检测；对11号外显子突变无阳性发现者，再进行ckit 9号外显子的扩增检测；无ckit 9号外显子突变者，再进行13 号和17号外显子的扩增。所用引物序列、退火温度和PCR产物片段大小见表1。表1 PCR扩增引物序列、退火温度和产物片段外显子编号引物序列（略）
    PCR反应条件为：95 ℃变性2 min；94 ℃ 40 s，退火40 s，72 ℃ 35 s，循环 30～35 次；最后72 ℃延伸5 min。以双蒸水代替模板作为阴性对照。
    PCR产物由北京华大中生生物科技发展公司纯化并测序（ABI 3100测序仪）。有突变的病例再行反向测序证实，并与NCBI基因库ckit基因序列进行比对。

　2 结果
    经免疫组化检测CD117、CD34、SMA和S100，确认10例为CD117阳性GIST病例。
    10例石蜡标本中仅4例成功提取了DNA，并进行了PCR扩增和测序。按细胞类型分为上皮样细胞2例，梭形细胞1例，混合型1例。按侵袭危险性分为高度危险性3例，其核分裂象(8～15)/50 HPF；中度危险性1例，其核分裂象(1～2)/50 HPF。该4例中，有3例检出了ckit基因第11号外显子缺失突变，均为累及557～558（WK）的缺失性突变。其中1例CD117（+）、CD34（），第11号外显子缺失突变，缺失片段为TGGAAGG，为杂合子性缺失突变；1例CD117（）、CD34（），第11号外显子缺失突变；1例CD117（）、CD34（），第11号外显子缺失突变。后两者均为纯合子性缺失突变。1例CD117（+）、CD34（），未检测到11、9、13、17号外显子的突变，属野生型序列。其余6例，经反复提取DNA和检测，均失败。
　　3 讨论
    本组10例GIST的组织病理学研究显示，GIST肿瘤细胞主要有3种类型：梭形细胞型、上皮样细胞型和梭形细胞与上皮样细胞混合型，但主要以梭形细胞型为常见。组织学检查表明，GIST肿瘤细胞的核分裂象数目差异很大，而且与肿瘤的大小不相关。光镜高倍视野下GIST肿瘤细胞核分裂象数目与肿瘤大小，均为FLETCHER等[6]对GIST侵袭危险度分级的主要指标，在评估病人预后上有重要意义。
    本文研究结果进一步表明，免疫组织化学几项检测指标，特别是CD117和CD34对GIST的诊断是必需的。95％以上GIST表达CD117阳性，70％左右表达CD34阳性。因此，CD117和CD34是GIST病理诊断和鉴别诊断的关键性免疫形态学指标。GIST从组织学上，被认为来源于胃肠道间质中的Cajal细胞和其前身细胞[7]，这两种细胞都显示CD117和CD34阳性表达；SMA和S100则是用于鉴别平滑肌和神经源性肿瘤的免疫学指标。
    本研究对10例GIST组织进行ckit基因突变检测分析，目的是揭示肿瘤赖以发生的突变基因靶点，寻找在基因水平上的序列异常改变，帮助临床选择恰当治疗方案。但是，其中6例检测失败。分析失败原因，主要是组织标本处理不规范，造成无法有效提取组织DNA。因此，规范GIST的组织处理过程，是必须首先解决的问题。
    本组GIST中有3例为ckit基因突变肿瘤，突变位点均位于11号外显子，并表现为纯合子缺失突变和杂合子缺失突变两种类型。ckit基因是一种原癌基因，它的配体是细胞因子，ckit基因被激活后会引起受体的二聚体，并促进酪氨酸磷酸化，启动细胞内的信号传导，产生一系列增殖、分化、凋亡的调节功能。ckit基因11号外显子是酪氨酸激酶抑制剂的靶向位点，因此是Gleevec药物作用的敏感位点。按基因分类诊断，是推荐选择Gleevec靶向治疗药物的适宜对象。而另1例病人的基因突变检测未发现ckit基因9、11、13、17号外显子突变，基因类型为野生型。同时，根据其肿瘤大小和核分裂象分级，属高侵袭危险性GIST者，免疫组织化学检测其CD117和CD34均为阳性，属对靶向治疗药物Gleevec不敏感的GIST肿瘤病人。因此，基因诊断分型是GIST的重要临床指标，为临床治疗提供依据，有重要意义。

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