3 讨论
通过基因重组进行质粒构建、原核诱导表达、蛋白纯化和复性的探索，拟为深入研究CRP内化入胞机制和胞内功能提供研究工具。在表达纯化的探索中，发现原核表达的人CRP重组蛋白的溶解性很低，基本上以包涵体形式存在，利用高浓度的尿素和盐酸胍等变性剂溶解包涵体的效果不佳，通过多次摸索，利用SKL、TritonX-100、SDS等去污剂和二硫键还原剂DTT增加了溶解包涵体和重组蛋白的能力，用金属离子亲和色谱方法获得较纯目的蛋白，在氧化还原体系GSH/GSSG和L-精氨酸条件下，通过缓慢降低去污剂的梯度透析方法对纯化的蛋白质进行复性处理。
蛋白质复性后，利用HPCE技术对重组蛋白的一般理化性质和结合活性进行检测。分离模式采用区带毛细管电泳（capillary zone electrophoresis, CZE），同时电泳液中加入少量（低于胶束浓度）的非离子型去污剂（Tween 20）以减少蛋白质在管壁上的粘附。在这种分离模式下，带正电荷的蛋白质由正极向负极迁移，并在负极端用LIF模组检测，带绿色荧光的蛋白质通过时可被检测。结果发现，当电泳液pH≤5时，方可检测到His-EGFP-CRP的荧光信号，因此提示融合蛋白His-EGFP-CRP的等电点（pI）接近于6，该蛋白质在低于其pI的溶液中带正电荷，易于在该电泳模式下分离检测。His-EGFP的检测结果与His-EGFP-CRP相近，表明2种重组蛋白pI接近。
与His-EGFP的单峰相比较，His-EGFP-CRP的检测出现多个峰，可能原因是复性后His-EGFP-CRP以多种结构形式存在。CRP阅读框由2个外显子和1个内含子组成，编码含187个氨基酸的单体蛋白［1］。在血浆、组织液和细胞内，CRP的结构形式具有多样性：有分子量为21 kD的单体形式，也有由5个相同的单体（亚基）以非共价交联的方式聚合成五角型盘状结构，还有研究发现单体可以聚合成为纤维状的结构［6］。这些结构的多样性在一定程度上可以解释CRP功能的多样性。本工作构建的融合蛋白是在CRP的3’端挂上EGFP和his标签，要使其能应用于CRP功能和内化机制的研究，其前提条件之一是增加的EGFP和his氨基酸序列不能影响CRP的结合活性。HPCE的结果显示复性后的His-EGFP-CRP可能存在单体和多聚体的结构形式，提示CRP的聚合特性没有受到His-EGFP影响。至于His-EGFP-CRP的多聚体结构形式，还需深入研究。
已有研究表明CRP能够与小核核糖体蛋白、组蛋白、层粘连蛋白、磷酸胆碱和磷酸乙醇胺等细胞内或细胞膜上的分子物质结合［1，7］。为了解His-EGFP-CRP是否具有CRP的结合活性，将His-EGFP-CRP与单核细胞THP-1的裂解物进行孵育结合，HPCE结果发现His-EGFP-CRP的检测峰增多了，提示His-EGFP-CRP与细胞裂解物中的一些分子结合形成了复合物；而单独的His-EGFP仍然为单峰，并没有形成复合物，说明His-EGFP-CRP结合活性是由其中的CRP部分所产生的，His-EGFP不影响其结合活性。本研究表明表达纯化及复性的CRP融合蛋白虽然在3’端增加了His-EGFP序列，但是仍然保留CRP的结合活性，可以用于CRP胞内功能和内化机制的研究。
致谢：感谢广州启动子生物科技公司在实验中给予的技术支持和帮助。
【参考文献】
［1］Volanakis JE. Human C-reactive protein: expression, structure, and function［J］. Mol Immunol，2001 （2-3）:189-197.
［2］Black S, Kushner I, Samols D. C-reactive Protein［J］. J Biol Chem，2004 （47）:48487-48490.
［3］Devaraj S, Clos T W D, Jialal I. Binding and internalization of C-reactive protein by Fcgamma receptors on human aortic endothelial cells mediates biological effects［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2005 （7）: 1359-1363.
［4］陈腾祥，李红梅，胡水旺，等. 重组人CRP的表达纯化及其内化进入Hela细胞的观察［J］.中国病理生理学杂志，2008 （6）:1155-1160.
