人参皂苷Rg1对6-OHDA所致MES23.5神经细胞损伤的保护作用(2)

    MES23.5细胞接种于96孔板或6孔板，用含体积分数0.05牛血清及Sato成分的DMEM/F12培养基，于37 ℃、体积分数0.05 CO2条件下培养。细胞汇合达80%~90%时，用6-OHDA处理细胞24或48 h，或Rg1预处理细胞24 h后，再用6-OHDA处理24或48 h，分为对照组（A组）、6-OHDA组（B组）、Rg1+6-OHDA组（C组）。
    1.3  MTT法检测细胞生长
    将传代细胞接种于96孔板中，每孔细胞数量为3×103个。当细胞均匀贴壁生长时，用不同浓度6-OHDA处理细胞48 h，或先用10-8 mol/L Rg1预保护细胞24 h，再用6-OHDA处理，48 h后去除培养液，加5 g/L的MTT 20 μL，于37 ℃、体积分数0.05 CO2培养箱中继续培养4 h，每孔加DMSO 100 μL，混匀后用酶标仪检测570 nm处的吸光度(A)值。计算细胞存活率［5］。
    1.4  实时荧光半定量反转录聚合酶链反应(real time RT-PCR)检测酪氨酸羟化酶（TH）和Bcl-2基因的表达
    将传代细胞接种于6孔板中，用10-8 mol/L  Rg1预保护细胞24 h，然后再用6-OHDA处理细胞24 h，Trizol法从细胞中提取总RNA，取1 μg总RNA进行逆转录。采用SYBR green染料法相对定量检测TH、Bcl-2和GAPDH的基因表达。TH上游引物序列为5′-AAAATCCACCACTTAGAG-ACC-3′；下游引物为5′-TAGCCACAGTACCGTTCC-3′。Bcl-2上游引物序列为5′-CCTGTGGATGACTGAGTACC-3′；下游引物为5′-CCCACTCGTAGCCCCTCT-3′。GAPDH上游引物序列为5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′；下游引物为5′-CCCTGTTGCTGTAGCCGTAT-3′。用未处理的样本做标准曲线，计算出靶基因的含量，并与内参基因GAPDH相比。
    1.5  统计学分析
    数据以x±s表示，应用SPSS 10.0统计软件进行单因素方差分析（One-Way ANOV）。
    2  结    果
    2.1  不同浓度6-OHDA对MES23.5细胞的毒性作用及Rg1的保护作用    MES23.5细胞经0、1、10、25、50、75、100、200及400 μmol/L的6-OHDA处理48 h，细胞的存活率分别为1.000±0.143、0.985±0.070、0.927±0.048、0.820±0.068、0.785±0.054、0.763±0.052、0.678±0.048、0.601±0.030及0.234±0.039。6-OHDA可剂量依赖性地降低MES23.5细胞的生存率（F=71.24，P<0.01）。应用10-8 mol/L Rg1预处理细胞24 h，可明显降低100 μmol/L 6-OHDA的毒性作用（F=14.63,P<0.01）。见表1。
    2.2  Rg1对6-OHDA诱导的TH基因表达的影响
    100 μmol/L 6-OHDA处理细胞24 h可明显降低TH基因的表达，应用人参皂苷Rg1预处理24 h后，可明显增加TH基因的表达，差异有高度显著性(F=9.80,P<0.01)。见表1。
    2.3  Rg1对6-OHDA诱导Bcl-2基因表达的影响
    100 μmol/L 6-OHDA可明显降低Bcl-2基因的表达，而人参皂苷Rg1预处理组Bcl-2基因的表达较6-OHDA组明显增强(F=15.34,P<0.01)。见表1。
    表1  Rg1预处理对6-OHDA诱导的MES23.5细胞存活率、TH和Bcl-2基因表达的影响
    3  讨    论
    PD是一种常见的中枢神经系统退行性疾病，主要病理改变是SNzc DA能神经元进行性变性缺失。6-OHDA是公认的可以诱发DA能神经元变性的神经毒素，可以直接抑制线粒体电子传递链复合物，导致ATP耗竭细胞变性死亡；也可通过单胺氧化酶B生成过氧化氢，再由Fe2+经Fenton反应生成羟自由基，造成DA能神经元变性、凋亡［6］。本研究应用6-OHDA损伤细胞MES23.5这一DA能神经元细胞系，研究人参皂苷Rg1的神经保护作用及其机制。MES23.5细胞是一种杂交瘤性DA能神经元细胞系,由大鼠胚胎中脑细胞与小鼠神经母细胞瘤-胶质瘤细胞系N18TG2杂交而成，可替代原代培养的DA能神经元用于研究神经变性疾病PD［7］。