山东籍汉族泛发性脓疱型银屑病患者发病中易感基因的定位研究(2)

    PCR反应：50 μl反应体系中含有基因组DNA 60　ng，浓度为50　pmol/μl 的上游引物和下游引物各2.5 μl，阳性对照引物用量为特异性引物的1/5，10×PCR缓冲液5　μl，25　mmol/L MgCl2 5 μl，2.5　mmol/L dNTP 5 μl，Taq-DNA聚合酶（Promega）1.5　u。扩增在DNA热循环扩增仪（Perkin Elmer）上进行，共35个循环，扩增条件参考文献［1,2］。
    1．2．4  基因型的确定：2%的琼脂糖凝胶电泳，100 V稳压30 min。紫外灯下观察，根据PCR产物的有无及大小确定基因型别。
    1．3  统计学分析  用直接计数法计算基因频率，两组间基因频率的比较采用χ2检验。P值均用Bonferron法进行校正得校正P值（Pc），即P值乘以实验系统所检出的基因数，显著性检验水平为0.05。用比值比(OR)代表疾病与HLA基因的相关性强度。
    2  结果
    2．1  基因组DNA抽提效果的检测  饱和盐洗法所提取的基因组DNA纯度及浓度，使用饱和盐洗法提取白细胞基因组DNA，用紫外分光光度仪(Pharmacia)自动测出所提DNA的纯度——A值(OD260/280)、双链DNA的浓度及标本中的蛋白质浓度。将所提取标本作50倍稀释后测得的DNA的纯度为1.621～1.853，双链DNA的浓度为161.19～388.61，标本中的蛋白质含量为0.1～0.4 mg/ml，均能满足本实验要求。
    2．2  HLA-DRB1以及HLA-DQB1亚区的DNA分型结果
    2．2．1  DNA扩增效果的检测：经饱和盐洗法所提取的基因组DNA样本经PCR扩增后，阳性者在1.8%的琼脂糖电泳凝胶上可见一清晰条带，分子量与预期值一致，与标准DNA的扩增产物完全相同。
    2．2．2  泛发性脓疱型银屑病患者和正常对照组HLA-DR基因频率的分布：结果见表1。表1  泛发性脓疱型银屑病患者和对照组 HLA-DR基因频率的分布注：△为Fisher精确概率法计算的P值，DR7的Pc值分别为0.042546

   与正常对照组相比，患者组HLA-DR7频率显著增高（χ2=13.05，P=0.0003，DR=4.50）；HLA-DR10的频率虽然也增高，但校正后无统计学意义。与正常对照组相比，原有寻常型银屑病病史的19例患者HLA-DR7、DR10频率显著增高；HLA-12的频率显著降低。
    2．2．3  泛发性脓疱型银屑病患者和正常对照组HLA-DQB1基因频率的分布：结果见表2。表2  泛发性脓疱型银屑病患者和对照组 HLA-DQB1基因频率的分布注：Fisher精确概率法计算的P值矫正后DQB1*0201、DQB1*0603的Pc值分别为0.0156156和0.025974
    与正常对照组相比，患者组HLA-DQB1*0201频率显著增高（χ2=10.49，P=0.0012，OR=3.0）； DQB1*0603频率虽然增高，但校正后无统计学意义。与正常对照组相比，原有寻常型银屑病病史的19例患者HLA-DQB1*0201、DQB1*0603频率显著增高。
    原无寻常型银屑病病史的17例患者各等位基因频率较对照组无显著性差别。
    3  讨论
    泛发性脓疱型银屑病是银屑病的一种类型，本组患者可有寻常型银屑病病史，而部分没有寻常型银屑病病史。1998年日本学者Ozawa等［1］对泛发性脓疱型银屑病与HLA抗原/基因相关性进行了研究，发现泛发性脓疱型银屑病的易感性与HLA-Cw1以及 HLA DQB1*0303明显相关，表明与泛发性脓疱型银屑病关联的HLA等位基因不同于寻常型银屑病。另一位日本学者将泛发性脓疱型银屑病分为原有寻常型银屑病病史和原无寻常型银屑病病史两种类型，前者发病年龄较晚，触发因素多为糖皮质激素治疗或不规则减量；后者发病年龄较早，常因上呼吸道感染诱发［4］。
    我们的研究结果显示HLA- DRB1*07及HLA-DQB1*0201等位基因频率在山东籍汉族泛发性脓疱型银屑病患者中显著高于健康对照组，即泛发性脓疱型银屑病与HLA- DRB1*07及HLA-DQB1*0201、DQB1*0603等位基因呈正相关，表明与泛发性脓疱型银屑病相关联的HLA等位基因不同于寻常型银屑病。对原有寻常型银屑病病史和原无寻常型银屑病病史两种类型进行分层研究，结果显示在原有寻常型银屑病病史的泛发性脓疱型银屑病患者中HLA-DRB1*07及HLA-DQB1*0201、DQB1*0603等位基因频率显著高于对照组；而在原无寻常型银屑病病史的泛发性脓疱型银屑病患者中DQB1*0602频率显著高于对照组；表明HLA-DRB1*07及HLA-DQB1*0201、DQB1*0603与原有寻常型银屑病病史的泛发性脓疱型银屑病相关联，DQB1*0602与原无寻常型银屑病病史的泛发性脓疱型银屑病相关联，此结果与国内研究结果［5，6］一致，均支持原有寻常型银屑病病史的泛发性脓疱型银屑病与原无寻常型银屑病病史的泛发性脓疱型银屑病具有遗传异质性的观点。