答：所谓简并引物是指根据肽链的氨基酸序列(或部分序列)，并充分考虑密码子的简并性而设计的、
用于PCR 扩增的混合引物群体，这种混合引物之间具有不同的碱基组成，但碱基的数量是相同的。由
于充分考虑了密码的简并性，在这种混合引物中必定有一种引物是可以和该基因的DNA 序列精确互 补。
7．简并引物设计的一般原则是什么? 答：(1) 选择保守区设计简并引物。
(2) 选择简并性低的氨基酸密码区设计引物。 (3) 注意密码的偏爱性。
(4) 使用尽可能短的引物，以降低简并性，最短可用15～20 个碱基。
(5) 由于Taq DNA 聚合酶在PCR 扩增时容易掺入错误碱基，所以设计的引物，其3’端尽量使用具
有简并密码的氨基酸。
8．如何用PCR 制备突变DNA 分子?
答：可用PCR 进行定点突变 (Site Directed Mutagenesis)，即在特定位点引入点突变。该突变可以
是碱基替代、插入或者缺失。为了在靶基因特定位点导入突变，在PCR 引物设计时，将一条引物设计
成与靶序列互补但在预期位点作碱基替换或缺失。在引物中的诱发突变序列应该位于引物的5’端或在
引物中间部位，但绝不能位于3’端。诱变引物的3’区域(至少6～10 个碱基)必须与靶DNA 完全互补
以使引物与模板的退火完全而且Taq 酶能延伸引物。PCR 反应先在低特异性环境下反应5～10 个循环
以使错配得以发生(即在松弛的温度下)，一旦少量的突变模板产生，就可以作为靶序列与引物完全互补。
扩增反应的终产物即是所需的含有突变的扩增DNA 分子，然后通过克隆和序列分析进行确证。
9. 用PCR 技术扩增目的DNA 片段时，需要一对特意合成的引物来限定目的片段的扩增区域，试说明
引物序列合成应遵循什么样原则。
答：1）引物长度一般为15～30 个核苷酸。
2）引物的碱基尽可能随机， G+C 含量一般占45％~55％。Tm＝4(G+C)+ 2(A+T) 3）引物自身不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。
4）两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3’端的互补重叠。
5）引物与非特异扩增区的序列的同源性不超过70％，引物3’末端连续8 个碱基在待扩增区以
外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。
6）引物3’端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板DNA 配对。
7）引物与模板结合时，引物的5’端最多可以游离十几个碱基而不影响PCR 反应的进行。
8）引物的5’端可以修饰，如附加限制酶位点，引入突变位点等。 10. PCR 技术体外扩增DNA 分子的基本原理是什么？
答：PCR 是在试管中进行的DNA 复制反应，基本原理是依据细胞内DNA 半保留复制的机理，以
及体外DNA 分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以
促使双链DNA 变成单链，单链DNA 与人工合成的引物退火，然后耐热DNA 聚合酶以dNTP 为原料
使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。PCR 全过程每一步的转换是通过温度的改变来控制的。需要重
复进行DNA 模板解链、引物与模板DNA 结合、DNA 聚合酶催化新生DNA 的合成，即高温变性、低 温退火、中温延伸３个步骤构成PCR 反应的一个循环，此循环的反复进行，就可使目的DNA 得以迅
速扩增。DNA 模板变性：模板双链DNA?单链DNA，94℃。退火：引物＋单链DNA?杂交链，引物
的Tm 值。引物的延伸：温度至70 ℃左右， Taq DNA 聚合酶以４种dNTP 为原料，以目的DNA 为模
板，催化以引物３’末端为起点的5’→3’DNA 链延伸反应，形成新生DNA 链。新合成的引物延伸链经
过变性后又可作为下一轮循环反应的模板PCR，就是如此反复循环，使目的DNA 得到高效快速扩增。
11．TaqMan 定量 PCR 扩增的原理是什么？
答：TaqMan 定量 PCR 使用3 个引物，或两个引物和一个特异性探针。两个引物接合到目的DNA 上下游，以进行目的DNA 的合成。第三个引物，或称探针，是特异合成的一段短的DNA 片段，可特
异性第接合到一条DNA 链中间。探针带有两个修饰基团，5’端荧光报告基团（R）和3’端的荧光淬灭
基团（Q），这两个基团由于距离靠近会发生荧光淬灭而检测不到荧光。随着PCR 的进行， TaqMan
探针接合到目的DNA 序列上，并且被具有外切酶活性的Taq DNA 酶逐个切除而降解。被切下来的荧
光基团（R）解除了荧光淬灭的束缚，会在激发光下发出荧光，因此所产生的荧光强度直接反应了扩增
靶DNA 的总量。
克隆策略
一、填空题
1．克隆策略有三层含义：① 采用什么样的技术路线将目的基因中克隆出来 ；② 用什么方法将目的
基因同载体连接 ；③ 通过什么方法将体外连接的DNA 分子导入适当的受体进行扩增或表达 。
2．假定克隆一个编码某种蛋白质的基因，必须考虑其表达的三个基本条件：
① 保持正确的可读框 ；② 能够使其转录的启动子 ；③ 具有翻译的起始和终止信号 。 3．现有的基因克隆策略大体上分为四类： 功能克隆 、定位克隆 、表型克隆 、 电子克隆。 4．受体细胞的感受态是 接受外源DNA 的生理状态 。
5．DNA 重组连接的方法大致分为四种：① 黏性末端连接 ；② 平末端连接；③ 同聚物加尾连接 ；
④ 接头/连接子连接。
6．将含有外源基因组一个酶切片段的质粒称之为含有一个 基因组DNA 克隆，各种此类质粒的集合体
称之为构建了一个 基因组DNA 文库 。
7．将含有一个mRNA 的DNA 拷贝的克隆称作一个 cDNA 克隆 ，源于同一批RNA 制备物的克隆群
则构建了一个 cDNA 文库 。
8．在构建cDNA 克隆之前，可以用 差示杂交 来富集一特殊的核苷酸序列。做法是：用来自于能够产
生目的蛋白的细胞mRNA 分子同来自于另一类型细胞 (不产生这种蛋白质，但亲缘关系密切) 的过
量mRNA 分子杂交。
9．一旦克隆了一个遗传定位的基因，就可以用 染色体步移 技术来鉴定基因组DNA 文库中与之相邻 的基因克隆。
10．只要知道基因组中某一特定区域的部分核苷酸组成，用 聚合酶链式反应（PCR） 可以将这段DNA
进行百万倍的扩增。
11．SD 序列是mRNA 分子中同 核糖体RNA 结合的序列，其结构特征是AGGAGG 的全部或一部分。
12．环状质粒的转化效率很低，通常是线性双链DNA 转化效率的 1% 。
13．cDNA 技术是进行真核生物基因克隆的一种通用方法，因为它可以用 mRNA 为模板，通过反转录
合成一个双链的、无 内含子 的基因，因而有利于在原核细胞中进行功能表达。
14．产生平末端的方法通常有：① 平切的酶 ；② S1 核酸酶切除黏性末端 ；③ DNA 聚合酶补平黏 末端 。
15．人工感受态的大肠杆菌细胞在温度为 0℃ 时吸附DNA， 42℃ 时摄入DNA。
16．影响酶切的主要因素之一是底物DNA，底物的影响包括 DNA 的浓度 、DNA 的纯度、DNA 的二
／三级结构、识别位点和邻近的特异性序列 。
17．Sal I 是识别6 个核苷酸的酶，其识别切割的理论值是 4096 个碱基就有一个切点，但在哺乳动物
中，大约 300kb 才有一个切点。
18．在精简基因组文库中，用标记的 突变体DNA 同未标记的 野生型DNA 杂交，最后建成的是 缺
失部分的DNA 库。
19．构建基因组文库时连接方法主要是 粘性末端连接法；而构建cDNA 文库，可用 接尾连接法 或 人 工接头连接法。
20．将携带有外源基因并能持久传递给子代的动物称为 转基因动物，这些外源基因就叫做转移的基因。
21．为了提高重组DNA 分子对E. coli 的转化效率，通常可采取 CaCl2 处理和 42℃处理2min 。
22．含有多种限制性内切核酸酶识别序列的DNA 片段称为 多接头/MCS/多克隆位点 。 23．两个基因融合所编码的新蛋白称为 融合蛋白 。
二、选择题(单选或多选)
1．重叠群 (contig) 是一群克隆，在这个克隆群体中每个个体( A )。 A．相互之间部分重叠 B．都是来自不同生物的克隆
C．插入片段位于不同染色体的不同区段 D．位于同一染色体的不同区段
2．根据构建方法的不同，基因文库分为基因组文库、cDNA 文库等。在下列文库中 ( C ) 属cDNA 文库。
A．YAC 文库 B．MAC 文库 C．扣减文库 D．BAC 文库
3．下面关于多克隆位点 (Multiple Clone Site，MCS)的描述，不正确的一项是( A )。 A．仅位于质粒载体中 B．具有多种酶的识别序列
C．不同酶的识别序列可以有重叠 D．一般是人工合成后添加到载体中 4．部分填补是DNA 体外重组中常用的一种技巧，填补时应 ( C )。 A．控制DNA 聚合酶的用量 B．控制酶反应的时间 C．限制dNTP 的种类 D．注意只能填补载体
5．EcoR I 切割载体DNA 和供体DNA 所产生的片段在用于重组连接前要( B )。 A．用65℃处理5～10min 使限制性内切核酸酶失活 B．用CIP 处理载体DNA 防止自身环化
C．进行琼脂糖凝胶电泳检测 D．上述说法都正确 6．在cDNA 技术中，所形成的发夹环可用( C )。 A．限制性内切核酸酶切除 B．用3’切核酸酶切除 C. 用S1 核酸酶切除 D．用5’切核酸酶切除 7．在DNA 的酶切反应系统中，通常( ABC )。 A．用SSC 缓冲液 B．加入Mg2+作辅助因子
C．加BSA 等保护剂 D．上述说法中，有两项是正确的 8．黏性末端连接法，不仅操作方便，而且( B )。 A．产生新切点 B．易于回收外源片段 C．载体不易环化 D．影响外源基因的表达
9．关于DNA 接头在基因工程中的作用，下列说法中哪一项不正确? ( D ) A．给外源DNA 添加适当的切点 B．用于人工构建载体 C．调整外源基因的可读框 D．增加调控元件
10．DNA 的结构对转化的影响很大，一般说来，转化效率最高的是( A )。 A．完整的线性双链DNA B．单链线性DNA
C．完整的环状双链DNA D．开口的双链环状DNA
11．cDNA 文库包括该种生物的 ( A )。
A．某些蛋白质的结构基因 B．所有蛋白质的结构基因 C．所有结构基因 D．内含子和调控区
12．下列关于建立cDNA 文库的叙述中，哪一项是错误的？( A )
A．从特定组织或细胞中提取DNA 或RNA B．用反转录酶合成mRNA 的对应单链DNA C．以新合成的单链DNA 为模板合成双链DNA D．新合成的双链DNA 甲基化 13．下列对黏性末端连接法的评价中，哪一项是不正确的? ( C ) A．操作方便 B．易于回收片段
C．易于定向重组 D．载体易于自身环化，降低重组率
14．关于感受态细胞性质的描述，下面哪一种说法不正确? ( C ) A．具有可诱导性 B．具有可转移性
C．细菌生长的任何时期都可以出现 D．不同细菌出现感受态的比例是不同的 15．以下哪些信息无法从cDNA 克隆中获得? ( B ) A．外显子序列 B．启动子序列
C．序列的相似性 D．编码产物的氨基酸序列 E．剪接的DNA 转录产物
16．从人基因组中分离、克隆一个基因所要面临的一个基本问题是：基因组大小有 ( D )碱基对，
而一个基因长度通常只有 ( D ) 碱基对。 A．几万亿，几百万 B．几万亿，几千 C．几十亿，几百万 D．几十亿，几千
三、判断题
1．外源基因 (或DNA 片段) 插入到某一基因内的位点后，这个基因不再有任何功能。错误，有可能 具有新功能
2．用不同的产生黏性末端的限制性内切核酸酶分别切割载体和外源DNA，得到的黏性末端是不亲和
的黏性末端。错误，同裂酶也能产生黏末端
3．基因组DNA 文库是含有某一生物中全部DNA 序列随机克隆的克隆群，而cDNA 文库是含有某一
生物中所有表达基因随机克隆的克隆群。错误，cDNA 文库只含有构建文库的细胞类型中表达的基
因，为某阶段、时期、组织中表达的基因
4．cDNA 克隆较之基因组克隆最重要的优越性就是它们含有一个基因的完整序列。错误，无内含子
5．通过差示杂交后制备的cDNA 文库使克隆那些只在特定分化细胞中表达基因的概率大为提高。正确
6．在染色体步移中，可通过DNA 测序知道已到达所感兴趣的基因。错误，通过转基因实验鉴定
7．一旦有了一套已知顺序的基因组克隆，通过从文库中获得覆盖目的突变基因所在基因组区的所有克
隆，就可以进行染色体步移。正确，
8．根据遗传连锁作图把基因定位在基因组中是定位克隆的第一步，它为分离特定的人的基因提供了一
