主细胞
后能够像质粒一样进行复制，并且能够被氯霉素扩增。
② 具有质粒载体的抗生素抗性基因的选择标记和克隆位点。
③ 插入片段的消化、连接及后来重组克隆的纯化与质粒载体相同。 ④ 具有λ噬菌体的包装和转导特性。与质粒载体转化细菌细胞不同，重组体像λ 载体一样，需体
外包装后转染细菌。
⑤ 包装后形成的 λ 颗粒用来感染大肠杆菌，重组DNA 像λ DNA 一样注入细菌细胞，并以COS 位点环化。由于缺乏λ 的其他DNA 序列，环化DNA 在细菌体内以质粒一样维持。
⑥ 简化了筛选。载体体积小，承载外源 DNA 片段大。如果载体的分子质量在5kb 的话，得到的
转导子几乎排除由载体自连的可能性，因为要被成功包装，至少要7 个分子的载体自连。尽管
如此，也是不能被包装的，因为COS 位点太多了。重组体只有达到32-45kb 才能有效包装体外
包装，这就提供了对重组体的正向选择。
⑦ 对转化体的选择是基于载体上的抗生素标记。 ⑧ 感染后形成菌落，而不是噬菌斑。 黏粒载体也有如下不足：
① 如果两个黏粒之间有同源序列，可能会发生重组，结果会使被克隆的片段重排或丢失。 ② 含不同重组 DNA 片段的菌落生长速度不同，会造成同一个平板上菌落大小不一。另外由于不
同大小的插入片段对宿主细胞的作用不同，会造成文库扩增量的比例失调。 ③ 包装过程复杂，包装效率不稳定，代价高。
核酸分离、纯化与测序、PCR 技术
一、填空题
1．SDS 是分离DNA 时常用的一种阴离子除垢剂，它有四个作用： ① 溶解膜蛋白及脂肪，从而使细胞膜破裂 ；
② 溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来 ； ③ 对RNase、DNase 有一定的抑制作用 ； ④ SDS 能够与蛋白质结合形成R-O-SO3
-?R+-蛋白质复合物，使蛋白质变性沉淀 。
2．酚是蛋白质变性剂，用酚抽提细胞DNA 时，具有两方面的作用：① 是蛋白质变性 ； ② 由于它能使蛋白质变性，故也能使核小体和核糖体解聚，释放出DNA 和RNA, 提高DNA 的得 率 。
3．用酚—氯仿抽提DNA 时，通常要在氯仿或酚—氯仿中加少许异戊醇。这是因为，异戊醇 是一种有
机溶剂，可以降低表面张力，从而减少气泡产生 。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的
上层含
DNA 的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。
4．同其他水解蛋白酶相比，蛋白水解酶K 具有两个显著的优点：① 水解能力强，作用范围广 ； ② 在
SDS 和EDTA 中仍保持高活性，可以同SDS 和EDTA 同时使用 。
5．在分离DNA 时要使用金属离子螯合剂，如EDTA 和柠檬酸钠等，其目的是 螯合Mg2+抑制核酸酶 的活性 。
6．用乙醇沉淀DNA 时，通常要在DNA 溶液中加入单价的阳离子，如NaCl 和NaAc，其目的是 中和
DNA 分子的负电荷，增加DNA 分子间的凝聚力 。
7．通常可在三种温度下保存DNA：4~5℃、-20℃、-70℃，其中以 -70℃最好。
8．引物在基因工程中至少有四个方面的用途：① 合成探针 ；② 合成cDNA ； ③ 用于PCR 反应 ；
④ 进行序列分析 。
9．Clark 发现用Taq DNA 聚合酶得到的PCR 反应产物不是平末端，而是有一个突出碱基末端的双链
DNA 分子。根据这一发现设计了克隆PCR 产物的 T 载体 。
10．在用SDS 分离DNA 时，要注意SDS 的浓度，0．1％和1％的SDS 的作用效果是不同的，前者 只
将RNA 分离出来 ，后者 可将DNA 和RNA 一同分离出来 。
11．在DNA 分离过程中，通常要进行透析，其目的是 除去小分子的无机离子 。 12．在分离质粒DNA 的菌体培养过程中，加入氯霉素有两个好处：① 可以扩增质粒DNA ； ② 抑制菌体数量，有利于裂解 。
13．在DNA 分离过程中造成DNA 分__________子断裂的因素很多，主要有：① 核酸酶降解 ；② 化学降解 ； ③ 物理剪切 。
14．在DNA 保存液中，常加一滴氯仿，主要是起 抑制真菌污染 的作用。
15．按照人们的意愿，改变基因中碱基的组成，以达到 基因突变 的技术称为 定点突变 。 16．在cDNA 的合成中要用到S1 核酸酶，其作用是切除在 第二链合成时形成的发夹环 。 17．在简并引物的设计中，常常要用到dI (次黄嘌呤)，原因是 dI 可以同任何碱基相配 。 18．在分离DNA 时，要戴手套操作，原因是 手上常有核酸酶 。 19．乙醇沉淀DNA 的原理是 乙醇使DNA 分子脱水 。 20．简并引物PCR 主要是根据蛋白质的氨基酸序列设计 一组混合引物 来合成相应的基因。 21．超离心法纯化质粒DNA 时，选用CsCl 作介质的优点是：① CsCl 与不同DNA 嵌合的能力不同 ；
② CsCl 可以自动形成梯度密度 ，从而使不同分子质量的DNA 分子得以分开。 22．可以用 透析法 除去DNA 溶液中的氯化铯。
二、选择题(单选或多选)
1．从细胞或组织中分离DNA 时，常用蔗糖溶液，目的是 ( B )。 A．抑制核酸酶的活性 B．保护DNA，防止断裂 C．加速蛋白质变性 D．有利于细胞破碎
2．不是所有松弛型质粒都需要进行扩增的，如pBS、pUC 载体系统就不必进行氯霉素扩增，
这是因为
这些质粒的拷贝数很高，达到 ( D )。
A．30~50 B．100~200 C．300~400 D．500~700
3．有两种确定核酸中核苷酸序列的方法：化学序列分析法 (Maxam-Gilbert) 和酶学序列分析法
(Sanger)。酶学测序法的基本原理／优点是 ( B )。
A．碱基与特殊染料间不同的相互作用 B．一个合成引物的延伸和DNA 合成的可靠终止 C．限制性位点与DNA 末端标记的相关性 D．可同时对DNA 双螺旋的两条链进行测序 E．反应是DNA 特异的，RNA 不会带来干扰，既减少纯化步骤，也节约开支 4．CsCl-EB 密度梯度离心法纯化质粒DNA 的原理是 ( C )。
A．氯化铯可以较多地插入到线状DNA 中 B．氯化铯可以较多地插入到SC DNA 中 C．EB 可以较多地插入到线状DNA 中 D．EB 可以较多地插入到SC DNA 中 5．关于cDNA 的最正确的说法是( C )。
A．同mRNA 互补的单链DNA B．同mRNA 互补的双链DNA C. 以mRNA 为模板合成的双链DNA D．以上都正确
6．用碱法分离质粒DNA 时，染色体DNA 之所以可以被除去，是因为 ( C )。 A．染色体DNA 断成了碎片 B．染色体DNA 分子质量大，而不能释放 C．染色体变性后来不及复性 D．染色体未同蛋白质分开而沉淀 7．下面哪一种特性不是密码所具有的? ( C ) A．偏爱性 B．简并性 C．重叠性 D．连续性
8．用SDS-酚抽提DNA 时，SDS 的浓度是十分重要的，当SDS 的浓度为0．1％时， ( B )。 A．只能将DNA 抽提到水相 B．只能将RNA 抽提到水相
C．可将DNA、RNA 一起抽提到水相 D．DNA 和RNA 都不能进入水相 9．关于碱解法分离质粒DNA，下面哪一种说法不正确? ( D ) A．溶液I 的作用是悬浮菌体 B．溶液II 的作用是使DNA 变性 C. 溶液III 的作用是使DNA 复性
D．质粒DNA 分子小，所以没有变性，染色体变性后不能复性 10．异戊醇的作用是 ( D )。
A．使蛋白质脱水 B．使DNA 脱水
C．帮助DNA 进入水相 D．减少气泡，促进分相
11．关于PCR 扩增停滞的原因有很多种，但下列各项中，( B )不是主要原因。 A．底物(模板)过剩 B．dNTP 的大量消耗
C．产物的聚集 D．非特异性产物的竞争性抑制
12．Clark 做了一个有趣的实验，发现Taq DNA 聚合酶可以不需要模板在双链DNA 的末端加一个碱基， 主要是加 ( B )。
A．dGTP B．dATP C．dCTP D．dTTP 13．PCR 反应的必备条件是( B )。
A. 至少有100 个起始DNA 分子 B．拟扩增的目的DNA 片段的部分序列信息 C. 扩增需要cDNA 模板 D. 至少100kb 长度的模板 E. 未损坏、未降解的DNA 样品
14．哪项技术适于分离完整染色体长度级别的DNA 分子? ( E )
A．PCR B．Southern 印迹 C. 杂交 D．转化 E. 脉冲电场凝胶电泳 15．DNA 带电荷的性质如何，是什么赋予DNA 这种电荷性质? ( C ) A．正电性，来自磷酸根 B．正电性，来自碱基
C．负电性，来自磷酸根 D．负电性，来自碱基 E．负电性，来自核糖基
16．当载有文库的菌落被转移到杂交膜上用于筛选时，需要碱性溶液处理的步骤，这一步骤的意义何 在? ( E )
A．促使文库DNA 结合到杂交膜上 B．启动杂交探针与互补序列间的反应 C. 标记DNA，便于检测 D．刺激DNA 复制，增加质粒拷贝数 E. 裂解菌体细胞，并使DNA 变性
17．在某些PCR 反应中必须使用简并引物，这是因为 ( A )。 A．设计的模板是蛋白质的一段肽链 B．简并引物合成较为方便 C．简并引物的退火温度较低 D．简并引物与模板杂交的效率最高 18. 你打算扩增下面所示的两段序列之间的DNA，
5’-GACCTGTGGAAGC----------------------CATACGGGATTG-3’ 3’-CTGGACACCTTCG-----------------------GTATGCCCTAAC-5’ 最适合的引物序列是（ B ）。
A．引物1，5’-CTGGACACCTTCG 引物2，5’-GTATGCCCTAAC B．引物1，5’-GACCTGTGGAAGC 引物2，5’-CAATCCCGTATG C．引物1，5’-CGAAGGTGTCCAG 引物2，5’-GTTAGGGCATAC D．引物1，5’-GCTTCCACAGGTC 引物2，5’-CATACGGGATTG 19. DNA 变性：( ACE )。
A．包括DNA 双螺旋的解链 B．可以由低温产生 C．是可逆的 D．是磷酸二酯键的断裂 E．包括氢键的断裂
三、判断题
1．氯霉素扩增时，加氯霉素的时间是主要的，因为加的太早，菌数不够；加入时间过迟，菌龄过老， 容易自溶。正确
2．所谓引物就是同DNA 互补的一小段RNA 或DNA 分子。正确
3．脉冲凝胶电泳采用一个很强的电场来分离非常长的DNA 分子，其原理在于迫使DNA 分子根据长
度的不同而具有不同的速度，并按大小顺序通过凝胶。错误，以S 形移动，移动速度与长度无关，
电场方向周期性变化，迫使DNA 改变方向，分子越大，改变方向所需时间越长，移动速度越慢
4．琼脂糖-EB 电泳法分离纯化CCC DNA 原理是根据EB 可以较多地插入到CCC DNA 中，因而迁移
速度较快。错误，EB 插入少，体积小，迁移快。插入EB 会使DNA 负超螺旋向正超螺旋转化，EB
会使DNA 显的紧缩，即向正超螺旋转化
5．如果PCR 的每一次循环都把上一次循环中合成的DNA 增加了1 倍，那么10 个循环就扩增了1000
倍，20 个循环就扩增了100 万倍，30 个循环就扩增了10 亿倍。正确
6．PCR 既能用于扩增任何天然存在的核苷酸序列，又能重新设计任何天然核苷酸序列的两
个末端。因
此，任意两个天然存在的DNA 序列都能快速有效的扩增，并拼接在一起。正确
7．最有效的制备纯RNA 的方法是让其在细胞中超表达，然后提纯。错误，最好是克隆编码该RNA 的
DNA 片段到病毒RNA 聚合酶有效识别的启动子下游，然后体外转录
8．大量制备已被克隆基因编码蛋白质产物的常用方法是体外转录和翻译。错误，常有方法是让蛋白质
在细胞中过量表达，然后纯化
9．通过报告基因与来自于目的基因上游和下游各种DNA 片段的结合，研究基因的调控序列。正确
10．温度敏感突变型是非常有用的，在这些突变型中，可以通过对温度的改变控制这些突变体中异常
表型的出现。正确
11．用人工合成的含有所需碱基变化的寡聚核苷酸，可以将特殊突变引入克隆的基因。正确 12．简并引物是根据已知DNA 序列设计的引物群。错误，根据已知蛋白质氨基酸序列设计的引物群
13．在DNA 储存液中加一滴三氯甲烷，可防止真菌的污染。正确
14．密码的偏爱性是指不同种属的生物对简并密码具有不同的使用频率。正确
15．引物设计时必须使引物的5’ 端与模板链一致，而3’则可以人为地修改以加入酶切位点序列。错误。 正相反
四、问答题
1．分离DNA 时，为什么要在缓冲液中加入一定浓度的EDTA 和蔗糖？
答：① EDTA 是螯合剂，可同Mg2+螯合，使核酸酶失去了作用的辅助因子，而被抑制活性。
② 蔗糖增加缓冲液的黏度，保护DNA 不易断裂。
2．分离DNA 用酚抽提蛋白质时，离心后，为什么蛋白质总是停留在水相和酚相之间？ 答：酚使蛋白质分子间脱水而变性，变性蛋白的密度比水大，但比酚小，因此停留在中间层。 3．溶菌酶是破坏细菌细胞的有效方法。但有些细菌孢子对溶菌酶不敏感，因如何处理？ 答：添加DTT、巯基乙醇或8.0mol/L 的尿素等增加细菌孢子对溶菌酶敏感性。 4．为什么从细胞中分离DNA 时往往会断裂？
答：(1) 胞内存在很高的核酸酶活性，DNA 裸露后，很容易遭到核酸酶的降解。 (2) 在分离DNA 的过程中，要用到一些酸碱等化学试剂，也会使DNA 断裂。 (3) 在DNA 的分离过程中要经过多次离心、吸取、转移等，产生的机械张力剪切会使DNA 断裂。
5．在DNA 分离过程中，酚通常与氯仿联合使用，即使不联合使用也要在苯酚抽提后用氯仿再抽提一 次，为什么?
答：原因是酚和水有一定程度的互溶，所以单独使用酚抽提DNA，最终不能除去酚，残留的酚会
使起切割和连接作用的限制性内切核酸酶和连接酶变性。氯仿也是蛋白质变性剂，它不与水互溶，但
是能够同苯酚互溶。这样，酚和氯仿联合使用，就可以带走残留的酚。 6．何谓简并引物 (degenerate primer)?
