补充实验 荧光法测定维生素B2片剂中核黄素含量
一、实验目的
1、 了解荧光分光光度计的主要结构及工作原理
2、 掌握荧光光度计的操作技术和测定维生素片B2中核黄素的实验方法 二、实验原理
某些物质被某种波长的光（如紫外光）照射后，会在极短时间内，发射出较入射光波长为长的光，这种光称为荧光。吸收什么波长范围的光和发射什么波长范围的光，这与被照射的物质有关。而所发射的荧光的强度与该物质的浓度有如下关系：
-alc
If=KфI0（1-e）
式中：If为荧光强度；K为仪器常数；ф为荧光物质的荧光量子产率；I0为入射光
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强度；l为样品池厚度；c为荧光物质的浓度（mol?l）；a为荧光物质的摩尔吸光系数。
当溶液浓度较稀时，则If=KфI0alc
可见，在稀溶液中，当入射光强度、样品池厚度、仪器工作条件不变时，测得的荧光强度与荧光物质的浓度成正比。
维生素B2，又叫核黄素，是橘黄色无臭的针状结晶，其结构式为
OHHOHOHOHHHHHNNOH3CH3CNHNO
核黄素易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。
核黄素B2在230～490nm范围波长的光照射下，激发出峰值在526nm左右的绿色荧光，在pH为6～7范围内荧光强度最大，在pH=11的碱性溶液中荧光消失。基于上述性质建立维生素B2的荧光分析法，选择合适的激发波长、荧光波长和实验条件，即可进行定量测定。 三、实验用品
1、 仪器 荧光分光光度计，离心机，离心管，酸度计或pH试纸，移液管，容量
瓶（25ml、50ml、100ml），比色管（25ml），烧杯（50ml）
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2、 试剂 50μg?ml核黄素，冰醋酸（5%），盐酸（1：1），氢氧化钠（10%），市
售维生素B2片剂
四、实验步骤
1、配制10?g·mL?1的核黄素标准溶液：
移取50?g·mL?1核黄素（维生素B）10mL，用5％醋酸溶液稀释定容到50.00mL。
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2、实验条件的选择
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（1）、激发光波长和荧光波长的选择 准确移取10μg?ml的核黄素标准溶液1.0ml于25ml容量瓶中，用5%醋酸溶液稀释至刻度，摇匀。转移部分溶液至样品池中，利用荧光分光光度计测得该样品的扫描功能测得最适的入射光的波长为451nm，强度最
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大的荧光峰值为526nm。将荧光分光光度计的荧光波长暂设定在526nm处，在220～500nm波长范围内对激发波长进行扫描，记录激发光谱曲线，约在265nm、372nm、451nm有三个峰。然后将激发波长设定在451nm处，在460～700nm波长范围内对荧光波长扫描，记录荧光光谱曲线，约在526nm处荧光强度最大。从激发光谱及荧光光谱上确定最佳的激发光波长和最佳荧光波长。
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（2）酸度的选择 于一组25ml容量瓶中各加入10μg?ml的核黄素标准溶液1.0ml，然后分别用1：1盐酸、5%醋酸和10%氢氧化钠溶液稀释至刻度，摇匀后用酸度计或pH试纸测定溶液的pH，并于荧光分光光度计上测出相应的荧光强度，考察酸度对荧光强度的影响，从中确定最佳调节pH的溶液。 2、标准溶液的绘制
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准确移取10μg?ml的核黄素标准溶液0ml，0.5ml，1.0ml，1.5ml，2.0ml，2.5ml分别臵于6个25.00ml容量瓶中，用1.（2）所确定的pH溶液稀释至刻度，摇匀。测定标准系列溶液的荧光强度。 3、样品测定
用移液管准确移取一定量的含维生素B的溶液于25.00mL容量瓶中，再用上述pH
2溶液稀释至刻度，摇匀制成试液。在与标准曲线一致的实验条件下测定样品的荧光强度，在标准曲线上查出维生素B的浓度并根据样品取样量和稀释倍数，计算出原溶液中维
2生素B的含量（μg?ml-1）。
2五、结果与讨论
1、从激发光谱及荧光光谱上确定最佳的激发光波长和最佳荧光波长。
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2、计算出原溶液中维生素B2的含量（mg〃L） 六、思考题：
1、 为什么选择Ex442nm～Em526nm为定量时的波长对？ 2、 维生素B2片剂稀释的倍数如何确定？ 七、注意事项：
维生素B2水溶液遇光易变质，标准溶液应新鲜配制，维生素B2的碱性水溶液亦变质。
八、拓展实验：
1、验证“发射光谱的形状与激发波长无关”
2、如何区别瑞利散射峰、拉曼散射峰、2次或3次光的波峰 3、影响维生素B2荧光强度因素的研究
荧光物质与所处的外界环境，如激发光、溶剂、溶液pH值、荧光熄灭剂及温度等，都会影响物质的荧光量子效率，甚至影响物质的分子结构及立体构象，从而影响荧光光谱和荧光强度。 （1）、探索不同pH值条件下对维生素B2荧光强度的影响。
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