壁外，它具有活细胞的一切特征。 2. 如何通过组培获得突变体
（1）. 组织培养之前的变异及其选择：体细胞变异---分离---组培---再生为植株。
（2）组织培养期间的变异及其选择：指在组培过程中对培养物（愈伤组织）施加某种处理，使之发生变异后再进
行选择。这种方法往往能收到比较好的效果。
（3）组织培养后的选择和鉴定：指对组培后的植株的一些变异进行选择、利用的方法。 原理：诱变剂的继续作用，主要是形态性状，如株型、叶色等；
这种选择方式中所用的培养基一般不包含特定的选择因素，但往往包含诱变剂，由此产生的变异植株可能出现
某种有益的变异，将再生植株种在田间或温室内进行选择。这种选择多局限于形态性状，如株型、叶色以及其他可 见的性状。
3. 体细胞无性系选择中应注意的问题？ （1）选择目标的确定（选择前的准备工作）： 主要考虑三个因素：
① 性状的意义，如抗逆性，品质等；
② 目标性状基因的数目；单基因易于识别；多基因难识别； ③ 考虑该性状的显隐性；显性的当代表现，隐性的下代表现
（2）外植体的选择：外植体（explant）是指用于组织培养的植物组织或器官。一般而言，外植体越嫩、分化程度
越低，越容易培养。选择外植体要考虑： ① 基因型；选易于组培的品种 ② 植物的合适部位；分生组织
③ 考虑它的合适年龄；玉米幼胚 10～11 天 （3）培养系统的选择：
由外植体到植株再生，根据经过的途径过程不同，可以把组培分成 2 种组培系统：
? 器官发生系统--再生植株由愈伤组织直接分化而成；过程：愈伤组织----再生植株，上部愈伤组织形成叶、
芽，下部形成根
? 胚胎发生系统---外植体首先形成愈伤组织，再由愈伤组织分化出来类似于种子胚的胚状体（embryoid），胚
状体进一步发育成熟而形成完整植株。
过程： 愈伤组织----胚状体----再生植株。愈伤组织形成胚状体，由胚状体再生植株。 影响组培系统（器官、胚胎）的决定因素：外植体的基因型；培养条件；基因型与培养条件的互作?? （4）无性系变异的选择
总的原则：选可以遗传的无性系。无性系变异通常在愈伤组织阶段就有所表现，但是它在再生植株中却有可能
不再出现，而且并非出现在植株上的变异都能遗传，因此必须选择到目标性状稳定才算成功。 对连锁遗传现象的处理方法：
通常具有目标性状的无性系变异植株往往同时具有并发的其他不良的变异。解决这类问题的办法有二：
? 选择的方法 在大量无性系中筛选具有尽可能少的并发变异的个体；
? 杂交的方法 选用两个都具有目标性状的无性系杂交，从他们的后代中筛选没有不良变异
的重组体。
4. 植物体细胞杂交的重要环节？ 方法:
A 、 化学法诱导融合
关键是：融合剂的选用，早期用 0.25 mol/L 的 NaNO3 和高 Ca2+作融合剂；后来改用聚乙二醇(PEG)结合高 Ca2+ 高
pH 溶液处理，可大大提高融合率。
其特点是：处理量大、频率高、不影响再生而又不需昂贵的设备；是主要方法。 其缺点是：处理时间过长，有时不易掌握，有时形成多元原生质体融合体。
B、物理法诱导融合: 近年来又研究出一种电融合技术，先在交流电场下形成原生质体凝聚体，然后用直流电脉冲
刺激，使膜发生融合。
5. 未分化植株再生植株的两种系统？
6. 如何进行杂种细胞的鉴别和选择？
胞质杂种与体细胞杂种在核的组成上往往有明显区别，这种差别通常用以下方法才能鉴别： ① 再生植株的花部和营养体的形态观察； ② 细胞学检测（显微镜法）； ③ 生化鉴定；
④ 分子生物学分析；
第十六章：基因工程
1. 基因工程技术的理论和技术基础
指利用一些先进的现代生物技术，使外源的 DNA 通过载体植入植物体内，并使外源的 DNA 在植物体内表达。这
一过程称为重组 DNA 或基因工程，这一过程中所需要的技术称为重组 DNA 技术。 基因工程的理论和技术基础： ① 分子生物学中心法则的确立；
② 限制性内切酶及其它工具酶的发现； ③ DNA、RNA 和蛋白质的序列分析；
④ DNA 和 RNA 合成技术和转移基因载体的发现； 2. 用基因工程改造植物性状的主要内容和步骤？ 大体上要经过以下 5 个步骤： ① 获取外源 DNA 或目的基因； ② 获取目的基因的载体；
③ 把目的基因连接到载体上，获得 DNA 重组体；
④ 使重组 DNA 进入受体细胞，即实现外源 DNA 的转化；
⑤ 被转化的受体细胞再生成完整植株，外源 DNA 在受体内表达。 （一）分离基因的途径：
1. 通过 RNA 反转录为 cDNA：首先提取目的基因所编码的 mRNA，mRNA 经纯化后经过反转录程序，以其 为模板复制出 cDNA。
2. 从基因文库中获取目的基因： 对于大多数基因而言，cDNA 并不等于其天然结构基因，因为 cDNA 中缺少天然基因中的启动部分和内含子 （intron）。由于在 DNA（天然基因）转录 mRNA 时，其启动部分和内含子没有转录到 mRNA 中；所以大多数
mRNA 中并不包含完整的遗传信息。因此，要用纯化的 mRNA 探针，到事先构建的基因文库中去钓取与之对应 的目的基因。
（二）Ti 质粒及其改造：
一切基因工程载体都是由某种细菌质粒或病毒来充任，而在众多的载体中目前仅有 Ti 质粒在转化植物受体方面
取得较多的成功。所以 Ti 质粒是当前植物基因工程中最常用的载体系统。 （三）重组 DNA 的制备：
已经分离或合成的基因一般都保存在大肠杆菌内的一类辅助质粒中（如pBR322）。在制备重组DNA 时，将pBR322
从大肠杆菌中提出，再导入农杆菌中，使之与经过改造的 Ti 质粒（即 pGV3850）发生一个单交换，前者所携带
的目的基因便转移到 Ti 质粒之中，从而形成目的基因与 Ti 质粒的重组体
（四）重组 DNA 进入植物体——转化：通常是使植物原生质体与农杆菌共培养，14~30 小时后抗生素除去农杆 菌，在选择性培养基中选择转化体（即接受 Ti 质粒的植物细胞）。还可以利用组织进行转化的方法。例如叶的圆
盘（用打孔器切下），茎段和根段等，利用它们的伤面与农杆菌接触转染，效果很好。
（五）被转化受体的再生与鉴定：经过鉴定证实已被转化的受体，无论是原生质体、细胞或某些组织，都要经过
愈伤组织进而诱导出再生植株。最后还要再植株水平上鉴定目的基因是否表达，以及能否连续多代稳定地表达。
否则就不能达到改造植物的目的。
除了上面两种方法外，也有一些不通过载体系统直接把外源基因导入受体细胞的方法。 3. 生物技术在作物育种中的应用前景？
在植物育种中利用重组 DNA 技术方面，可望在短期内取得以下成果： 1. 把抗除草剂基因转化到烟草、大豆、马铃薯、油菜及林木之中。 2. 在更多植物基因组中插入抗病和杀虫基因。
3. 为了提高特异氨基酸水平（如大豆中的蛋氨酸）可以修饰编码同源贮存蛋白的基因，或者转移表达异源贮
存蛋白基因，这种异源贮存蛋白质的氨基酸成分可以补充自然蛋白质的氨基酸成分。
4. 把脂肪酸合成酶基因接上一种特别的启动子，插入油料种子植物中，可以增加植物种子中油的生成。
预计 21 世纪，人们将培育成不要施肥、不需施用杀虫剂、除草剂及其它化学药品的超级植物，由于植物间有性
杂交障碍的克服，将创造出具有更丰富更优越性状的植物，使之成为新颖、高级产品的原料。如用
植物制品代替
石油化工产品，创造特质油、药材、调味品和香料制品的原料植物，以及其他能源植物，从而极大程度提高它们 的利用范围。
第十七章：分子标记辅助选择育种
分子标记的利用：遗传图谱的构建；系统发育关系分析；种质资源分类；品种注册，专利保护；病毒鉴定；体细胞
杂种鉴定；MAS?? SSR 的基本原理：
? SSR 两端的序列多数是保守的单拷贝序列；
? 根据微卫星 DNA 两端的单拷贝序列，设计一对特异性引物，利用 PCR 技术，对每个座位的微卫星 DNA 序 列进行扩增； ? 电泳分离。
SSR 标记的主要特点有：
（1）数量丰富，广泛分布于整个基因组； （2）具有较多的等位性变异；
（3）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；（4）实验重复性好，结果可靠；
（5）由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，因此对一些植物，其开发有一定困难，费用也较高。 一、主基因定位
基因定位（ Mapping of genes ）是指通过遗传作图的方法，确定基因与遗传标记之间的关系。 基因定位通常指的是主基因的定位。而微效基因的定位通常用专有名词 QTL 定位。主基因－－－质量性状基因 基因定位的原理
基因定位的基本原理是通过分析分子标记与表现型之间的连锁关系，确定基因在遗传图谱中的位置。 表型分析
对作图群体的基本要求：
作图群体是基因定位中不可缺少的试验材料。对作图群体的基本要求是： （1）双亲具有相对性状的差异；如抗和感
（2）双亲应具有较高程度的多态性，以便找到紧密连锁的分子标记； （3）作图群体的大小应符合要求；
（4）作图群体中相对性状的分离应符合孟德尔规律。 表型测定：
在基因定位中，目的基因的基因型是通过它的表现型来确定的，因此表现型测定是决定基因定位质量的关 键。表型测定要求：
（1）试验误差要小
（2）测定标准要统一 应以双亲和 F1 为对照，并统一标准； （3）表型测量要准确
（4）必须采取基因专一性的检测方法，如抗病鉴定中只能使用特定的菌种，而不能使用混合菌种等。 表型数据的整理：
原始的表现型数据都是通过一定的测量方法获得的，具有特定的单位，如长度、
重量、百分比等。由于质
量性状的特点，作图群体一般表现为不连续的分布，因此可以将作图群体分成若干个组。为了满足作图软件的需要，
分别用不同的数字代表不同组的表现型，并与标记基因型的数值相一致。 分子标记的分析 已定位标记的利用：
通过遗传图谱的构建，很多分子标记在染色体上的位置已经确定，因此只要找到与基因连锁的分子标记，
就可以确定基因在染色体上的位置。这类标记有 RFLP 标记和 SSR 标记等。
已定位标记的利用方法：通常是从现有的遗传图谱中，按一定距离均匀选取分子标记。
1）亲本多态性的分析，筛选出具有多态性的分子标记；
2）作图群体的标记基因型分析，找到与目的基因连锁的分子标记。 未定位标记的利用：
有些分子标记是随机标记，如 RAPD 和 AFLP 标记等， 这类标记通常没有确定在染色体上的位置，因此
每次使用都是随机的。利用随机标记只能以随机的方式，从大量的标记中筛选出与目的基因连锁的分子标记。
基因定位的目的：分子标记辅助选择，图位克隆 筛选与基因连锁的分子标记的方法：
1:混合池法（bulked segregation analysis，BSA）
混合池（bulk）分析是快速筛选出与目的基因连锁的分子标记的一种方法。
混合池的组成： “混合池”由作图群体中具有相同相对性状个体的 DNA 组成。在作图群体中，通常选择具有同
一相对性状的 10-20 个体的 DNA 组成一个混合池。这样，在一个作图群体中，两个相对性状各自组成一个混合池。
组成混合池的个体，应具有典型的表型。
理论上，两个不同相对性状的混合池除了目的基因的基因型不同外，其余基因型是相同的。
常用的分池方法有 2 种： 1. 表型分池
2. 标记基因型分池
（1）基于基因表现型的 BSA 法：根据目标性状的表现型对分离群体进行分组混合的。 在作图群体中，通常选择
具有同一相对性状的 10-20 个体的 DNA 组成一个混合池。组成混合池的个体，应具有典型的表型。这样，在一个
作图群体中，两个相对性状各自组成一个混合池。理论上，两个不同相对性状的混合池除了目的基因的基因型不同
外，其余基因型是相同的。
混合池法的基本原理：
在实际利用中，两个混合池通常与两个亲本一起做分子标记的分析（前提：两个亲本的带型有差异）
? 当两个混合池的带型无差异时，表明该标记与目的基因不连锁；
? 当两个混合池的带型有差异时，表明该标记与目的基因可能存在连锁关系。
