银杏叶多糖的提取与含量测定
摘要:以干燥的银杏叶为原料，采用水提醇沉法提取其中的活性物质-银杏叶多糖，并测定其含量。通过单因素实验研究了乙醇沉淀浓度、乙醇用量和沉淀次数对银杏叶提取纯化率的影响，从而确定了提取银杏叶多糖的优化条件为：料液比1:30，浸提温度80℃，浸提时间3h，浸提次数2次，在浸提液真空浓缩至原来体积30％，用1.5倍体积无水乙醇沉淀2次，干燥，洗涤，银杏叶多糖得率为4.925%。 关键词： 银杏叶多糖；单因素试验；提取纯化；含量测定
Abstract: Choosing dried ginkgo leaves as raw material. We used the method of water extraction and alcohol precipitation to extract the active substance. The polysaccharides of ginkgo leaf, and determined the content of it. Using single factor experimental method, we studied the impacts of alcohol precipitation concentration, alcohol dosage and precipitation times on the purity of extraction, and concluded that the optimal condition to extract polysaccharides is: material liquid ratio-1:30.extraction
temperature-80℃,
extraction
time-3
hours,
extraction times-twice. When extraction solution vacuum concentrated to 30% of the original volume, use 1.5 times the volume of the absolute alcohol to precipitate twice, and then, wash, dry, the yield of polysaccharides reached 4.925%.
Keywords: polysaccharide; single factor experiment; extraction
1 引言
近几十年来, 人们发现糖类在生物体中不仅是作为能量资源或结构材料, 更重要的是它参与了生命科学中细胞的各种活动, 具有多种多样的生物学功能。到目前为止, 已有近300种的多糖类化合物从天然产物中被分离提取出来。其中, 从植物中尤其是从中药中提取的水溶性多糖最为重要。这些活性多糖的生理活性、化学结构以及工艺提取条件成为多糖研究的前沿阵地, 取得了很大的进步[ 1~3 ] 。银杏树为我国特产, 有活化石之称,有着丰富的药用价值, 其叶、果和外种皮等皆具有药用开发价值[ 4 ] 。目前对银杏多糖的研究主要集中于银杏叶和银杏外种皮中提取的银杏多糖的药用价值[ 5 ]，已经有很多实验证实银杏叶多糖有生理活性促进作用。安徽省淮南师范学院陈群、刘天骄的研究结果表明: 银杏叶多糖( GBLP) 对小鼠S180实体瘤、腹水瘤的生长有抑制作用和对荷瘤小鼠免疫调节作用, 表明GBLP具有较强的免疫调节活性和抗肿瘤作用[ 6 ] 。费瑞,徐冬梅,温得中等研究得出银杏叶多糖对人脐静脉内皮细胞与HL-60细胞粘附有影响作用[ 7 ] 。侯华新、黎丹戎等研究发现银杏叶多糖可增加化疗药物对鼻咽癌细胞、宫颈癌细胞的治疗敏感性, 是一种有希望的放射增敏剂[ 8 ] 。陈有福, 李永强, 韩 毳,等研究证明中药银杏叶提取物在精神科有广泛应用[ 9 ]。同样有许多研究者在银杏叶多糖提取、分离、纯化以及含量测定上有显著成绩[ 10~18 ]。银杏叶多糖提取方法的优化为进一步在理论上证实银杏叶多糖的多种活性功能提供支持, 同时也为中药现代化的研究开辟道路。对于进行银杏叶多糖的产业用途也有一定的借鉴意义。本文采用水提醇沉提取银杏叶多糖, 并用单因素试验法对提取工艺进行了优化, 为银杏叶多糖的进一步深入开发利用打下基础。
2 实验器材的准备
a.实验所需试剂：无水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、85%乙醇、80%乙醇、苯酚、
硫酸（80%）、葡萄糖标准溶液、双蒸水
b.实验用具：烧杯、蒸发皿、试管、玻璃棒、量筒、移液管、容量瓶
c.实验设备：紫外分光光度计、恒温干燥箱、粉碎机、水浴锅、离心机、冰箱、
水浴锅
3 实验过程
3.1 实验的基本步骤
提取、纯化方法银杏叶多糖提取、纯化步骤
a. 银杏叶处理：实验前用70℃恒温干燥箱将银杏叶再烘1次 b. 恒温提取：按1:30固液比加水，在恒温水浴中恒温提取。
c. 离心：提取后用离心机以5 000 r/min离心20 min，收集上清液，残渣同前
再提取1次，合并两次上清液。
d. 浓缩：用真空干燥箱对纯化后的离心液进行浓缩。
e. 醇沉淀：加入一定量的一定浓度的乙醇，放入冰箱静置一定时间 f. 离心：对醇沉的白色絮状多糖沉淀进行离心。
g. 洗涤：得到的多糖用无水乙醇清洗后放入小烧杯中，在水浴锅中蒸干后，放
入80℃烘箱中干燥。
3.2 标准曲线的建立
多糖含量测定采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖为标准样品。
精确称取0.1g葡萄糖，用蒸馏水定容至100ml容量瓶中，摇匀备用。吸取上述1mg/ml的葡萄糖溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00分别用蒸馏水稀释至50ml容量瓶中，得到不同浓度的葡萄糖标准溶液。从各个瓶中准确移取2.00ml，置于25ml具塞比色管中，加入5%苯酚溶液1.00ml，摇匀，迅速
加入浓硫酸5.00ml，静置5min后，置于沸水浴加热15min，冷却至室温，用分光光度计在490nm处测定吸光度，制作标准曲线。
3.3 单因素实验 3.3.1 醇浓度的影响
称取已粉碎的银杏新叶5g5份，分别加入锥形瓶中，各加入150ml蒸馏水，并分别编号1~5号，于80℃水浴中浸提3h。取出离心，取上清液，残渣同前再浸提一次，取出离心，合并两次上清液。上清液在60℃下浓缩成30%的体积，分别加3倍体积的无水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、85%乙醇、80%乙醇，置冰箱中沉淀24h。再次离心，取沉淀，用85%、95%和无水乙醇反复洗涤，干燥，按标准曲线绘制项下方法测定其吸光度并计算多糖含量。
3.3.2 醇沉淀次数的影响
称取已粉碎的银杏新叶5g3份，分别加入锥形瓶中，各加入150ml蒸馏水，并分别编号1~3号，于80℃水浴中浸提3h。取出离心，取上清液，残渣同前再浸提一次，取出离心，合并两次上清液。上清液在60℃下浓缩成30%的体积。1号中加入3倍体积无水乙醇；2号中加入1.5倍体积无水乙醇，沉淀12h后，离心，取沉淀，上清液再加入1.5倍体积无水乙醇，沉淀12h；3号中加入1倍体积无水乙醇，沉淀8h后，离心，取沉淀，上清液再加入1倍体积无水乙醇，沉淀8h后，离心，取沉淀，上清液再加入1倍体积无水乙醇，沉淀8h。再次离心，取沉淀并合并，用85%、95%和无水乙醇反复洗涤，干燥，按标准曲线绘制项下方法测定其吸光度并计算多糖含量。
3.3.3 新叶与落叶的比较
称取已粉碎的银杏新叶5g2份，银杏落叶5g2份，分别加入锥形瓶中，各加入150ml蒸馏水，并分别编号1~4号，于80℃水浴中浸提3h，取出离心，取上清液，残渣同前再浸提一次，取出离心，合并两次上清液。上清液在60℃下浓缩成30%的体积。加1.5倍体积的无水乙醇，醇沉12h，离心，取沉淀，上清液再加入1.5倍体积无水乙醇，沉淀12h。再次离心，合并两次沉淀，用85%、95%和无水乙醇反复洗涤，干燥，按标准曲线绘制项下方法测定其吸光度并计算多糖含量。
4 结果与讨论 4.1葡萄糖标准曲线图
C（mg/ml） A620nm 0 0 0.001 0.013 0.002 0.089 0.003 0.122 0.004 0.194 0.005 0.206 0.006 0.213 表1 葡萄糖标准曲线表
图1 葡萄糖标准曲线图 由葡萄糖标准曲线可以看出，在490nm处的吸光度值随着葡萄糖浓度的增加而线性增加，线性方程为y=0.040x-0.0419。由此，我们可以根据葡萄糖标准曲线图而推断出银杏叶多糖的含量。 4.2 影响银杏叶多糖提取的单因素实验 4.2.1 不同乙醇沉淀浓度对银杏多糖的率的影响 组数（A） 银杏新叶（g） 乙醇浓度 乙醇沉淀次数 1 5 无水乙醇 2 5 95%乙醇 3 5 90%乙醇 4 5 85%乙醇 5 5 80%乙醇 1（1次） 1（1次） 1（1次） 1（1次） 1（1次）
