同学们，这是本学期细胞工程实验的目录和讲义，请自己先预习，上课
时会提问的。
试验一 培养基母液的配制 实验二 植物初代培养 实验三 愈伤组织增殖
实验四 愈伤组织增殖和芽分化 实验五 愈伤组织中丙二醛含量的测定 实验六 愈伤组织中过氧化物酶活性的测定 实验七 生根培养
实验八 愈伤组织中多糖或黄酮的提取（两次实验） 实验十 —— 十二 动物细胞原代培养 实验十三 细胞活性检测
17周考试（2节课）
实验一、实验室常规操作、器皿的洗涤、灭菌，配制母液
一、实验目的：1.了解实验室常规操作。
2.理解灭菌的原理和操作 3.掌握玻璃器皿的洗涤方法。 4.学会配置培养基母液。 5.学会无菌操作的必备知识。
二、原理：组织培养是利用植物细胞全能型的理论，将植物组织离体培养在无菌条件下将植物组织重新分化
成，直至长出新的植物个体。所以无菌操作是实验成败的关键。
三、仪器药品
仪器：1000ml的容量瓶、小烧杯、1000ml的大烧杯、玻璃棒、电炉、高压灭菌锅、试剂瓶、100ml容量
瓶、酒精灯、镊子、解剖刀、解剖盘、打火机、培养皿、滤纸
药品：硝酸钾、硝酸铵、硫酸美、硫酸锰、硫酸锌、磷酸氢二钾、氯化钙、硼酸、甘氨酸、维生素B1、
维生素B6、肌醇、氯化钴、升汞、钼酸钠、EDTA-Na2、硫酸亚铁、烟酸、生长素（NAA）、细胞分裂素（6-BA）、碘化钾、PH试纸、氢氧化钠、盐酸、无水酒精、75%酒精
四、操作步骤：1.配制培养基母液
（1） 大量元素（×20）
KNO3 38g NH4NO3 33g
CaCl2 6.45g（单独溶解） MgSO4·7H2O 7.4g K2HPO4 3.4g （2） 微量元素（×200）
碘化钾 0.166克
大量元素中的氯化钙要单独溶解后，在和其他物质溶解后的溶液混合。定容到1000ml。否则将会出现沉淀，导致实验失败。（氯化钙用一个小烧杯单独溶解） 硼酸 1.24克 硫酸锰 4.46克 硫酸锌 1.72克 钼酸钠 0.05克 硫酸铜 0.0025克 氯化钴 0.0025克 （3）铁盐（×200）
EDTA-Na2 7.46克
硫酸亚铁 5.56克 （4）有机（×200）
维生素B1 0.1克 维生素B6 0.02克 肌醇 20克 烟酸 0.1克 甘氨酸 0.4克 （5）激素
微量元素中的硫酸铜、钼酸钠和氯化钴用量太少，无法称量，可以先称取10倍量配成100ml溶液，再取其中10ml即可。和其他成分一起定容到1000ml。 两种物质分别用400ml水单独溶解，然后将二者混合，定容到1000ml即可。 称取50mg6-BA，加少量盐酸（或乙醇），溶解后用蒸馏水定容到50ml。
称取50mg NAA，加入少量1M氢氧化钠溶液（或乙醇），溶解后用蒸馏水定容到50ml。（思考：为什么6-BA要用盐酸溶解，而NAA要用氢氧化钠溶解。）
注意：配制培养基母液时，试剂瓶要洗干净、烘干备用。
实验二、培养基的配制、灭菌以及愈伤组织的诱导
一、实验目的：1.了解培养基母液以及培养基的配方法和过程。
2.理解灭菌的原理和操作
3.掌握接种时外植体的消毒和接种的方法。 4.理解细胞的全能性理论。
二、原理：利用植物细胞全能型的理论，将植物组织离体培养，通过人工培养环境的诱导，使细胞恢复分生
的状态，再用激素诱导，使植物组织重新分化成器官。直至长出新的植物幼苗。
三、仪器药品
仪器： 1000ml的大烧杯、玻璃棒、电炉、高压灭菌锅、酒精灯、镊子、解剖刀、解剖盘、打火机、培
养皿、滤纸
药品：大量元素母液，微量元素母液，有机元素母液，铁盐母液、蔗糖、生长素（NAA）溶液、细胞分
裂素（6-BA）溶液、琼脂pH试纸、氢氧化钠（1N）、盐酸(1N)、无水酒精、75%酒精 植物材料
四、操作步骤：
1.培养基的配制:取大量元素母液 50ml ，微量元素5ml，有机元素5ml，铁盐5ml。（为什么取这一个量？）。加入800ml左右的水，琼脂7.5克在电炉上煮到沸腾，到琼脂全部融化（液体澄清，无块状琼脂存在），加入蔗糖30克，搅拌均匀，加入激素6-BA0.5ml，2，4-D0.5ml。调pH到5.8。然后分装到150ml锥形瓶中，塞好棉塞，包瓶口。每瓶培养基分装50ml为好。
3.培养基灭菌
将分装好的培养基和实验中所要用到的工具（镊子、解剖刀、培养皿、烧杯等）和蒸馏水一起放入高压灭菌锅进行加热。
当气压达到0.05Mpa时，打开放气阀放出冷气。（思考：为什么？），当气压回到0时，关闭放气阀加热。当气压达到0.1M大气压时，计时20分钟（保持温度在121度~126度之间）。然后等气压降低到0.05Mpa时，放气，打开灭菌锅，取出培养基和工具，冷却备用。
4.取材和接种
（1）取材：应取植物的幼嫩叶片或者叶柄。尽量去掉生长态势不好的组织。
（2）外肢体消毒：将取下的材料用自来水冲洗20分钟，洗去灰尘，放入超净工作台，用75%的酒精消毒30秒（切忌时间过长，为什么？），再用无菌水洗涤一次，倒入升汞，消毒3~5分钟，取出材料，用无菌水清洗3次以上。
（3）接种：将消毒好的材料进行剪切，去掉灭菌时叶片切口接触消毒试剂的部分（为什么？），将材
2
料切成4×4mm的小块。平整的放置在培养基的表面。（不要放入培养基内部，为什么？）。
（4）培养：将接种好的材料放入光照培养箱中进行培养。 5.思考题：（1）灭菌的时候，为什么要先将冷气放掉？ （2）外植体是越大越好还是越小越好，为什么？ （3）接种的时候怎样才能保证无菌？
（4）为什么接种时先要将材料洗涤3次以上？
实验三、组织愈伤组织增殖
一、实验目的：
掌握.了解植物激素对植物愈伤组织培养中的作用和激素使用的原则。 二、实验原理：
在植物愈伤组织分形成以后，可以改变激素浓度（或者不用改变，使具体情况而定），可以使愈伤组织大量繁殖，为根芽的分化提供原料，有利于植物幼苗大量繁殖以及此生代谢物的生产。 三、仪器和药品：
1. 仪器：培养皿、剪刀、镊子、锥形瓶、滤纸、烧杯、电炉、石棉王、高压灭菌锅
2. 药品：大量元素母液、微量元素母液、铁盐母液、有机元素母液、生长素母液、蔗糖、琼脂 四、实验步骤： 1.培养基的配制：
取50ml大量元素母液，微量元素母液、铁盐母液、有机元素母液个5ml，放入1000ml烧杯中，称取蔗糖30克，琼脂7.5克加入850ml水（因为少被只能丁荣到900ml，所以不能超过这一体积）。在电炉上煮沸，直至琼脂完全融化（注意：不能出现年条状物质，煮至完全澄清）。
将煮好的培养基放在实验台上，加入细胞分裂素素母液500μl，生长素母液500μl，搅拌均匀，用氢氧化钠溶液将pH调整到5.8~6.0之间。 2.分装与灭菌
将配制好的培养基分装到150ml的锥形瓶中（每个瓶子大约50ml），用封口膜包好，放入高压灭菌锅，同
时将实验操作所使用的培养皿（要垫上滤纸）、剪刀、镊子包好米病房如灭菌锅进行灭菌（121℃-126℃保持20分钟）。 3.接种
将灭菌好的培养基取出，让其冷却，凝固后放入超净工作台。同时也将灭菌好的操作工具放入超净工作台。打开紫外灯，杀菌20~30分钟。
杀菌完毕，关掉紫外灯，打开照明灯，点燃酒精灯，将接种材料放入，并用70%究竟擦手和外植体的培养瓶，确保所有的操作过程无菌。
无菌条件下将愈伤组织取出，放到培养皿中（已灭菌），用解剖刀将愈伤组织上的外植体切下来，切成合适的大小。然后接种到培养瓶中（注意：愈伤组织稍微插入培养基中），放入光照培养箱中培养（光照14小时）。 思考题：
1.为什么愈伤组织形成以后要进行增殖？
2. 愈伤组织形成增殖为什么尽量切掉原来没有形成愈伤组织的外植题？
实验四、组织培养中芽的诱导
一、实验目的：
掌握.了解生长素对植物芽分化培养中的作用和激素使用的原则。
二、实验原理：
在植物愈伤组织分形成以后，改变激素浓度（提高细胞分裂素的浓度，使生长素浓度与细胞分裂素的的比例较低），可以控制植物芽器官的分化，促进芽的形成。有利于植物幼苗的形成。 三、仪器和药品：
3. 仪器：培养皿、剪刀、镊子、锥形瓶、滤纸、烧杯、电炉、石棉王、高压灭菌锅
4. 药品：大量元素母液、微量元素母液、铁盐母液、有机元素母液、生长素母液、蔗糖、琼脂 四、实验步骤： 1.培养基的配制：
取50ml大量元素母液，微量元素母液、铁盐母液、有机元素母液个5ml，放入1000ml烧杯中，称取蔗糖30克，琼脂7.5克加入850ml水（因为少被只能丁荣到900ml，所以不能超过这一体积）。在电炉上煮沸，直至琼脂完全融化（注意：不能出现年条状物质，煮至完全澄清）。
将煮好的培养基放在实验台上，加入细胞分裂素素母液500μl，生长素母液200μl，搅拌均匀，用氢氧化钠溶液将pH调整到5.8~6.0之间。 2.分装与灭菌
将配制好的培养基分装到150ml的锥形瓶中（每个瓶子大约50ml），用封口膜包好，放入高压灭菌锅，同时将实验操作所使用的培养皿（要垫上滤纸）、剪刀、镊子包好米病房如灭菌锅进行灭菌（121℃-126℃保持20分钟）。 3.接种
将灭菌好的培养基取出，让其冷却，凝固后放入超净工作台。同时也将灭菌好的操作工具放入超净工作台。打开紫外灯，杀菌20~30分钟。
杀菌完毕，关掉紫外灯，打开照明灯，点燃酒精灯，将接种材料放入，并用70%究竟擦手和愈伤组织的培养瓶，确保所有的操作过程无菌。
无菌条件下将愈伤组织取出，放到培养皿中（已灭菌），用解剖刀将愈伤组织尽可能的切成合适的大小。然后入培养瓶中（注意：愈伤组织稍微插入培养基中），放入光照培养箱中培养（光照14小时）。 思考题：
1.为什么芽分化培养中，细胞分裂素的比例较高？
2.培养基配制中，经常有不凝固的现象，为什么？该怎样预防？
实验五、组织培养中根的诱导
一、实验目的：
1.了解生长素对植物生根培养中的作用和激素使用的原则。 2.掌握培养基的配制方法。 3.掌握转瓶培养中的无菌操作技术。 二、实验原理：
在植物愈伤组织分化成芽以后，改变激素浓度（降低或者取消细胞分裂素的浓度，是生长素浓度较高），可以控制植物器官的分化，促进根的形成。有利于植物幼苗的栽培培养。 三、仪器和药品：
5. 仪器：培养皿、剪刀、镊子、锥形瓶、滤纸、烧杯、电炉、石棉王、高压灭菌锅
6. 药品：大量元素母液、微量元素母液、铁盐母液、有机元素母液、生长素母液、蔗糖、
琼脂 四、实验步骤： 1.培养基的配制：
取50ml大量元素母液，微量元素母液、铁盐母液、有机元素母液个5ml，放入1000ml烧杯中，称取蔗糖30克，琼脂7.5克加入850ml水（因为少被只能丁荣到900ml，所以不能超过这一体积）。在电炉上煮沸，直至琼脂完全融化（注意：不能出现年条状物质，煮至完全澄清）。
将煮好的培养基放在实验台上，加入生长素母液200μl，搅拌均匀，用氢氧化钠溶液将pH调整到5.8~6.0之间。
2.分装与灭菌
将配制好的培养基分装到150ml的锥形瓶中（每个瓶子大约50ml），用封口膜包好，放入高压灭菌锅，同时将实验操作所使用的培养皿（要垫上滤纸）、剪刀、镊子包好米病房如灭菌锅进行灭菌（121℃-126℃保持20分钟）。 3.接种
将灭菌好的培养基取出，让其迅速冷却（最好用冰块冷却），凝固后放入超净工作台。同时也将灭菌好的操作工具放入超净工作台。打开紫外灯，杀菌20~30分钟。
杀菌完毕，关掉紫外灯，打开照明灯，将接种材料放入，点燃酒精灯，并用70%究竟擦手，确保所有的操作过程无菌。
无菌条件下将无菌苗取出，放到培养皿中（已灭菌），用解剖刀将苗上的愈伤组织尽可能的切下来。然后将无菌苗接入培养瓶中（注意：形态学下部插入培养基中），放入光照培养箱中培养。 思考题：
1.为什么生根培养中，最好切除芽上的愈伤组织？
2.培养基配制中，经常有不凝固的现象，为什么？该怎样预防？
实验六 丙二醛（MDA）的测定
一、实验目的
1.掌握植物体内丙二醛含量测定的原理及方法。 2.了解丙二醛积累对细胞的伤害 二、实验原理：
植物组织或器官在衰老或逆境下遭受伤害，往往发生膜脂的过氧化作用。膜脂过氧化的指标有很多，如丙二醛（MDA）的产生、过氧化物的碘量滴定、氧吸收、共轭双键测定等。由于MDA的测定方法简便，所以常用来评价植物脂过氧化强弱的指标。 测定组织或器官脂质的过氧化反应所产生的丙二醛含量时，通常
利用硫代巴比妥酸（TBA）在酸性下加热与组织中的MDA产生显色反应，反应产物是粉红色的3,5,5-三甲基噁唑2,4-二酮。用分光光度计测定532nm及600nm波长时的光密度值，根据光密度的大小可计算MDA含量。
逆境
O HN S N
H
O
膜脂的过氧化作用 O O O H
HS
N H
100 CO HN 丙二醛
OH
N
O
HO
N H
2
+
H
S
硫代巴比妥酸 TBA
丙二醛
3,5,5′-三甲基恶唑2,4-二酮
（三甲川）
三、实验材料：实验室培养的愈伤组织
实验仪器：分光光度计、匀浆器、离心机、离心管、水浴锅、试管 药品：10%三氯乙酸（TCA）；0.6%硫代巴比妥酸，先加少量的氢氧化钠（1 mol/L）溶解，再用10％的三氯
乙酸定容；石英砂。 四、实验步骤：
1 MDA的提取 称1g愈伤组织，加入5ml 磷酸缓冲液（50mmol，pH值为7.8）及少量石英砂，于冰浴中研磨提取，匀浆液以12000g 离心力作用下（4度）离心10min，其上清液即为MDA提取液。 2 MDA的测定 取1ml MDA提取液，加3ml 27％三氯乙酸和 1ml 2%TBA。混和液在95度水浴中保温30min后，立即置于冰浴中冷却，然后离心10min，于波长532nm和600nm下测定OD值。 五、结果计算
以测得的OD532减去OD600的非特异吸收值，按155mmol-1cm-1消光系数计算MDA含量。 分别计算衰老和对照组的值。
MDA浓度(μmol/L)=6.45(D532-D600)-0.56D450
D450、D532、D600分别代表450nm、532nm和600nm波长下的光密度值。 六、注意事项：
1. 0.1-0.5％的三氯乙酸对MDA—TBA反应较合适，若高于此浓度，其反应液的非专一性吸收偏高； 2. MDA-TBA显色反应的加热时间，最好控制沸水浴10-15min之间。时间太短或太长均会引起532nm
下的光吸收值下降；
3. 如待测液浑浊，可适当增加离心力及时间，最好使用低温离心机离心。
4. 低浓度的铁离子能增强MDA与TBA的显色反应，当植物组织中铁离子浓度过低时应补充 Fe3+（最
终浓度为0.5 nmol·L-1）
5. 可溶性糖与TBA显色反应的产物在532 nm也有吸收（最大吸收在450 nm），当植物处于干旱、高温、
低温等逆境时可溶性糖含量会增高，必要时要排除可溶性糖的干扰。 思考题：
1. 通过丙二醛含量测定能够解决什么理论和实际问题？ 2. 说明膜脂过氧化作用的对植物的影响。 3. TBA为什么要溶解在三氯乙酸中？
4. 为什么要测定反应液在600nm下的吸光度？
5. 丙二醛反应液为什么加热时间过长会影响测定结果？
实验七 过氧化物酶活性的测定
一、实验目的
了解过氧化物酶的作用；掌握常用的测定过氧化物酶的方法----愈创木酚法。 二、实验原理
过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与光合作用、呼吸作用以及生长素的氧化等都有密切的关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。 在过氧化物酶的催化下，过氧化氢将愈创木酚氧化成茶褐色产物，该产物在470nm处有最大光吸收，故可以通过吸光度的变化测定过氧化物酶的活性。 三、仪器与设备、试剂 材料：愈伤组织
试剂：0.05mol/L、PH5.5的磷酸缓冲液；0.05愈创木酚溶液；2%过氧化氢。 设备：722型分光光度计、离心机、研钵（匀浆器）、容量瓶、量筒、吸管、试管 四、实验步骤 1.制备酶液
取1.0克愈伤组织放入匀浆器，加入5ml研磨承匀浆，再用3ml缓冲液洗涤匀浆器，将匀浆液转入离心管中，于4000rpm离心10min，上清液转入50ml容量瓶中，定容。低温保存。 2.活性测定
取2.9ml磷酸缓冲液、1.0mlH2O2、1.0ml愈创木酚混匀，加入0.1ml酶液。迅速放入34℃水浴中保温3分钟，然后迅速稀释一倍。对照以水代替酶液，在470nm处比色，每隔一分钟记录一次吸光度，共记录5次，然后以每分钟吸光度变化0.01为一个酶活力单位。 五、结果计算
过氧化物酶活力= ΔA470×VT W×Vs×0.01t 其中：ΔA470为反应时间内吸光度的变化；W为愈伤组织重量；Vs为测定时所取的酶液提及；t反应时间，VT为提取的酶液总体积。
实验八 超氧化物岐化酶（SOD）的活性测定（选做）
一、实验目的
了解超氧化物岐化酶（SOD）的作用，掌握氮蓝四唑法测定超氧化物岐化酶的方法。 二、实验原理
超氧化物岐化酶普遍存在于动、植物体内，是意中清除超氧阴离子自由基的酶，它催化反应将氧分子所携带的一个电子和氢离子生成过氧化氢，过氧化氢可以进一步被分解。
本实验是根据超氧化物岐化酶一直氮蓝四唑在广夏的还原作用来确定酶活性的大小。在有氧化性物质存在的条件下，核黄素可以被还原，在有氧条件下后者极易被再氧化生成氧自由基，可以将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大光吸收。而SOD可以清除氧自由基，从而抑制了甲腙的形成。所以反应的颜色越深，酶的活性就越低。据此可以计算酶活性的大小。 三、材料、仪器与试剂 材料：培养的愈伤组织。
仪器：高速离心机、分光光度计、试管
试剂：0.05mol/L磷酸缓冲液，130mol/L甲硫氨酸，750μmol/L氮蓝四唑，100μmol/L EDTA-Na2，20μmol/L核黄素（避光保存） 四、实验步骤 1.制备酶液
取1.0克愈伤组织放入预冷的匀浆器，加入5ml预冷缓冲液，研磨成匀浆，再用3ml缓冲液洗涤匀浆器，将匀浆液转入离心管中，于10000rpm离心20min，上清液即为酶液，低温保存。
2.显色：取5ml试管4支，2只作为对照管，2只作为反应管，按照下表加入各溶液
试剂 磷酸缓冲液 用量ml 1.5 最终浓度 MET EDTA-Na2 核黄素 NBT 酶液 蒸馏水 总体积 0.3 0.3 0.3 0.3 0.05 0.25 3.0 13mmol/L 75μmol/L 10μmol/L 2μ 对照管用缓冲液代替
混合均匀后将一支对照管放入黑暗处，其他各管照强光反应20分钟。 五、结果计算
SOD的活性按照单位抑制NBT光还原的50%为一个酶活力单位，按照下式计算：
(A对照-AE)×V SOD总活力= (W×Vt×A对)/2 式中：V是样品总体积；A对照为对照管的吸光度，AE为样品管吸光度；Vt为测定时样品用量。W为样品鲜重。
实验九、十愈伤组织中多糖的提取（和黄酮二选一）
这次实验为物质提取，需要两次才能完成，多糖和黄酮二选一做
实验步骤：
1 称取2g愈伤组织，磨碎，加5ml水研磨成浆。
2 加入等体积氯仿，剧烈震荡，去氯仿层。反复萃取两次。
3 补加水至80ml，超声波处理10min，然后80℃ 水浴提取2小时。 4 葡萄糖标准液的标准曲线的绘制
精确称取 100℃烘至恒重的葡萄糖 50mg，用水溶解并定容到500mL容量瓶中，分别准确吸取 0mL、 0 .4mL、 0 .6mL、 0 .8mL、 1. 0mL、 1. 2mL、1.4mL、1.6mL、1.8mL、2.0mL葡萄糖溶液于比色管中，以蒸馏水补充至3.0mL，再加入 6％的新蒸苯酚溶液 2．0mL，摇匀，迅速加入 5．0mL浓硫酸，室温静置20 min后摇匀 ．40℃恒温水浴 15 min，在 486nm下测吸光度，空白用蒸馏水代替，作标准曲线。
5 将提取后的溶液加热浓缩（或旋转蒸发浓缩），至10ml左右体积。
6 加入等体积氯仿正丁醇（氯仿：正丁醇 = 4：1）溶液，剧烈震荡去蛋白，处理2-3次。 7 取水相，加入5倍体积95%的乙醇沉淀至少8h。（可见白色絮状沉淀） 8 5000 r／min离心 5 min后弃上清，在沉淀中加入70%乙醇洗涤 2次。 9 将所得的沉淀70℃烘干，称量，记录质量。 10 多糖含量的测定
取 0．025 g多糖粗制品，研磨后加少量去离子水溶解 ．转入 25 mL容量瓶中定容 。取 1 mL样品液稀释 10倍 ，取稀释后的样品液 2 mL于试管中 ，依次加入 0．06 g／mL的苯酚 1 mL，浓硫酸 5 mL，静置 10 min摇匀 ，40℃恒温水浴 15 min后取 出，测定 0D486值 ，依据葡萄糖标准曲线计算含量。
实验十一、十二 愈伤组织中黄酮的提取(和多糖二选一)
1 称取5-10g愈伤组织，研磨成浆。
2 至于烧杯中，加20mL的95%乙醇，超声波处理10min
3 处理后的样品转入索氏提取器，补加95%乙醇，至固液比为1:15，80摄氏度的条件下回流提取2小时 4 提取液经抽滤后，去除固体残渣，滤液60摄氏度旋转蒸发仪中浓缩至浸膏状 5 石油醚萃取至石油醚层无色
6 水相再经正丁醇萃取，取正丁醇萃取物，保存备用。 7 鉴定实验：显色反应
（１）紫外光下呈色反应：将提取溶液点在滤纸上，在紫外光下观察
（２）浓氨水反应：将提取溶液点在滤纸上，干后再点1次，将滤纸在氨水上方熏2min，立即在紫外光下观察。在空气中放置5min后，再在紫外光下观察。
（３）三氯化铝反应：将提取溶液点在滤纸上，干后滴加1％三氯化铝乙醇溶液，吹干，在紫外光下观察。 8、含量测定
以芦丁为标准品制作标准曲线，移取适量黄酮提取液于l0ml的容量瓶中，加0.3ml的5％亚硝酸钠溶液，混匀放置6分钟，再加入0.3ml 10％硝酸铝溶液，混匀放置6分钟，然后加入4ml的4％氢氧化钠溶液，用30％乙醇定容，摇匀，放置10分钟，在500nm处测定吸光度(以不加提取液的试剂为空白)，根据回归方程（标准曲线）计算提取液中黄酮的含量。
实验十三、鸡胚的原代培养
（一）培养用品的清洗和消毒
一、实验目的
1. 了解细胞培养的常用器材。
2. 掌握细胞培养用品的清洗和消毒方法。
二、实验原理
细胞体外培养对培养环境的洁净程度和无菌要求很高。培养环境中的微生物会污染培养基使细胞培养失败；操作用具和培养瓶上残留的微生物降解物、无机离子和有机物会干扰培养细胞的贴壁，妨碍其生长。因
此细胞培养用品必须经过严格的清洗和消毒程序。一般常用的消毒方法有干热灭菌、湿热灭菌、过滤灭菌。
三、实验器材
洗衣粉、肥皂、5%HCl、三蒸水（双蒸水）、每大组（4个同学） 250ml锥形瓶（3个）、150ml锥形瓶（3个）、培养皿（4个）、眼科剪（1把）、钝头镊子（一把）、弯头镊子（一把）、细菌过滤器（加滤膜）（2个）、烧杯（100ml以上）（2个）、玻璃棒（2根）、量筒（500ml）（1个）、三层纱布（2）、离心管（1包）、枪头（1ml）（1包）、25ml培养瓶（4个）
四、实验步骤
1. 玻璃器皿的清洗
先用洗衣粉洗，然后肥皂水煮30min，水洗干净，再在5%HCl中浸泡30min，水洗，最后用蒸馏水淋洗3~5次。烘干、包装灭菌。
2. 金属器皿的清洗
水洗，然后用75%酒精擦拭，包装灭菌。
实验十三 鸡胚的细胞培养
（二）培养溶液的配制
一、实验目的
1. 了解细胞培养常用的培养液。 2. 掌握过滤除菌方法。
二、实验原理
细胞体外培养需要丰富的营养成分，常用的动物细胞培养基有199、DMEM、RAPI-1640等。体外培养时需要维持适当的渗透压，常用的平衡盐溶液有PBS、Ringer、Hank’s等。制备培养材料时，常采用机械解离、胰酶消化、螯合剂解离等方法。
三、实验步骤
1、199培养基的配制
称取0.49g 199粉末，溶解至50ml双蒸水中，用NaHCO3调pH至7.3~7.4。滴2滴1%的酚红，超净台上过滤除菌。使用前加入5ml （10%的）小牛血清。
2. Hank’s的配制
配制甲乙两液，高压灭菌，于超净工作台上混合。 另外配制1份不含钙和镁的Hank’s溶液。
注：甲、乙液配方（1L）：
甲液：NaCl 8g Na2HPO4.12H2O 0.15g KCl 0.4g KH2PO4 0.06g
CaCl2 0.14g NaHCO3 0.35g MgSO4.7H2O 0.2g 葡萄糖 1g 1%酚红 1ml 1 %酚红 1ml
3. 0.25%胰蛋白酶的配制
称取0.5g胰蛋白酶，溶解至200ml无钙和镁的Hank’s液中，滴1滴1%的酚红，超净台上过滤除菌。
实验十三 鸡胚的细胞培养
（三）原代培养
一、实验目的
1. 了解细胞原代培养的一般程序。 2. 掌握无菌操作技术。
二、实验原理、器材（略）
三、实验步骤
1. 取孵化9~11天的鸡蛋，用酒精消毒，转入超净台上，再用酒精消毒1次。
2. 用钝头镊子轻轻敲破鸡蛋大头端的蛋壳，移去蛋壳，小心不要让蛋壳落入蛋内。 3. 用镊子撕开并去掉气囊膜和虹膜。
4. 用尖头镊子夹住鸡胚颈部提出鸡胚，至培养皿中。
5. 用Hank’s液洗一次，去掉Hank’s，去掉鸡胚的眼睛、咀和爪子。
6. 用Hank’s洗一次，把鸡胚转入新的培养皿中，剪碎。 7. 加入5ml胰蛋白酶，转移至锥形瓶中，37℃ 消化30min。 8. 移去上清，加入5ml Hank’s，三层纱布过滤。
9. 滤液800r/min 离心8min，去掉上清，加Hank’s再次离心。
5
10. 沉淀用199悬浮，再次离心，加少量199悬浮沉淀，调整细胞密度为5.0×10/ml。 11. 转入含10ml的培养基中培养。
五、实验结果
无污染时，细胞在24h即可贴壁，72h即可生长成一层。如培养液迅速变黄，则表明有细菌污染，一直红色澄清则细胞没有生长，渐渐褪色澄清则细胞在生长。
实验十四 细胞的活性测定 （选做，优先做）
一、实验原理
细胞活性测定是细胞培养的基本技术，它是了解实验操作、生化物质处理和不同药物处理对细胞活性影响的简便手段，也是评定细胞冷冻效果的方法之一。
染料排除法是检查细胞活性常用的方法。其原理是细胞损伤或死亡时，某些染料可穿过细胞膜，与细胞内结构结合显色，而活细胞能阻止染料进入或通过特定的酶分解染料，从而产生不同的着色情况。因此可以通过细胞是染色效果的不同区别死细胞和活细胞。常用的染料有台盼蓝、TTC等。
FDA也广泛用于细胞的活性鉴定。染色后活细胞发绿色荧光，死细胞不发光。可通过荧光显微镜观察。
二、实验器材:
植物愈伤组织细胞、动物培养细胞、台盼蓝染料（FDA）、显微镜（荧光显微镜）、载玻片、盖玻片。
三、实验步骤
1取酶解的植物愈伤组织细胞或培养的鸡胚细胞，制备单细胞悬液。
2 取少量细胞悬液，按1：1加入0.1%的台盼蓝溶液，充分混匀，静置15分钟。 3 用吸管吸取细胞悬液，加到细胞计数板上，用10倍物镜观察。
4 观察1000个以上细胞，着色者为死细胞，不着色者为活细胞，计算活细胞的比例。
5 取细胞悬液一滴于载玻片上，加入0.02%的FDA稀释液，静置5分钟。荧光显微镜下观察，发绿色荧光的为活细胞，不发光的为死细胞。
思考题：还有哪些方法可以检测细胞的活性？举例说明原理和操作过程。
