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图3-12 NW-101引起MAPK家族蛋白磷酸化水平的变化
3.8 NW-101在HL-60细胞株中不引起活性氧簇（ROS）水平的上升
由于ROS是P38 MAPK通路活化的一个上游信号[30,31]，我们推测NW-101可能是通过升高ROS水平进而激活P38 MAPK通路引起G2/M期阻滞。为此我们检测了在HL-60细胞株中低浓度NW-101给药后的ROS生成情况。
1.2 μM NW-101作用0-6 h后，DCFH-DA避光染色，检测细胞内平均荧光表达水平，发现在HL-60细胞中药物作用后ROS水平没有明显的上升（图3-13）。
图3-13 NW-101(1.2 ?M)给药作用0、1、3、6 h后细胞内ROS相对水平
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4 讨论
氮芥类烷化剂是最早应用于临床的一类抗肿瘤药物，在一些恶性肿瘤的治疗中发挥重要的作用。该类药物主要通过将生物大分子烷基化引起DNA损伤从而导致细胞死亡。其广泛应用所引起的耐药性成为临床使用过程中的严重问题。新型烷化剂苯达莫斯汀因其独特的药理活性逐渐应用于临床治疗。苯达莫斯汀最早于1963年在德国合成，由于同时具有双氯乙基基团、苯并咪唑环和丁酸侧链而呈现出烷化和抗代谢的双重活性[32]。在1969年首次用于多发性骨髓瘤（MM）的治疗[2]，目前，在美国苯达莫斯汀被批准用于治疗慢性淋巴细胞性白血病（CLL）和对利妥昔单抗耐药的惰性B细胞非霍奇金淋巴瘤，而在德国则用于CLL、MM和非霍奇金淋巴瘤（NHL）的治疗[33]。
氮芥类烷化剂的毒性主要取决于其引起的双链交联，我们的前期研究显示，NW-101在较低浓度下即可引起明显的DNA双链交联，从而对细胞产生显著的细胞毒作用。
凋亡（apoptosis），希腊文意思是树叶从树上“凋落”，是细胞主动参与自身死亡的过程。凋亡程序有一些特殊形态学特征，包括质膜的改变，如细胞膜不对称性和细胞附着消失，胞浆和细胞核固缩，核内DNA裂解。到了晚期，凋亡细胞断裂成“凋亡小体”，并很快被巨噬细胞清除，而不会引起周围细胞的炎症损伤。凋亡最早的特征变化之一就是出现了一系列蛋白水解酶——Caspase酶。活化的Caspase酶裂解许多细胞内酶，引发凋亡细胞的特征性形态改变，这一过程的核心是Caspase-3的活化。另一个凋亡早期的变化是细胞膜对称性消失，包括质膜内侧的磷脂酰丝氨酸重新分布，由胞膜内侧翻转到胞膜外侧，而细胞膜的这种改变可以通过一种与带负电荷的磷脂高度亲和的蛋白——Annexin V来检测。凋亡晚期，另一个特征变化是核酸内切酶活化，将DNA断裂降解，使用凝胶电泳的方法，可以观察到DNA断裂片段形成的“ladder”现象。
凋亡时出现了一系列细胞内蛋白水解酶——Caspase酶的活化。Caspase酶具有催化活性，“C”代表具有半胱氨酸水解酶功能，“aspase”代表具有切断天冬氨酸末端的功能。在对哺乳动物同源基因ced-3（线虫C. Elegans的细胞死亡基因）的研究中，首次发现了具有半胱氨酸水解酶活性的Caspase酶家族。第一个发现的哺乳动物Caspase酶是ICE，即caspase-1。随后又发现了一系列Caspase酶，包括：Caspase-1（ICE）、Caspase-2（ICH-1，Nedd-2）、Caspase-3（CPP32，Yama，apopain）、Caspase-4（TX，ICH-2，ICErel-II）、Caspase-5（ICErel-III，TY）、Caspase-6（Mch-2）、Caspase-7（Mch-3，ICE-LAP3，CMH-1）、Caspase-8（MACH，FLICE，Mch-5）、Caspase-9（Apaf-3，ICE-LAP6，Mch-6）、caspase-10（Mch-4）、Caspase-13（ERICE）和Caspase-14（MICE）。按照序列同源性，Caspase酶可分为三种亚群：ICE类酶Caspase-1亚群（Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11和Caspase-12），ced-3类酶Caspase-3亚群（Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7、Caspase-8、Caspase-9和Caspase-10）和Caspase-2亚群（至今为止，只发现了Caspase-2）。Caspase酶由无活性的“原酶”（~30-55kD）水解活化而来：细胞发生凋亡时，原酶发生自身水
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解反应或由其他蛋白裂解，形成大亚单位（17-20kD）和小亚单位（10-12kD），二者组合，形成活化的Caspase酶。这些蛋白水解酶的大亚单位还含有小到六个氨基酸，大到几个kD不等的前区。因此，大亚单位的分子量可以很大，如活化的Caspase-1为35kD。水解后活化的Caspase酶的功能是对许多胞浆内和核内目标，如PARP、D4-GDI、DFF、MEKK等进行裂解、活化处理。
实验结果显示NW-101诱导细胞凋亡并表现出剂量及时间依赖性。数据表明，NW-101可诱导caspase-8的活化及对Bid的剪切，从而通过死亡受体介导途径介导凋亡。Caspase-8属于Caspase3亚家族，以无活性的前体形式合成，并于凋亡过程中在特定的天冬氨酸残基位点切割处理后相继活化。胞外的死亡信号通过死亡受体（DR）转入胞内后，Caspase-8被募集到DISC中形成二聚体，相互切割活化，进而活化下游的caspase-3或Bcl-2家族蛋白Bid，后者移位至线粒体，诱导细胞色素C释放，从而活化caspase-9和caspase-3，作为酶原而被激活，引起下面的级联反应，细胞发生凋亡（图4-1）。
图4-1 死亡受体信号通路
Caspase-9位于caspase级联反应上游。凋亡起始信号作用于线粒体，线粒体通透性增强，释放细胞色素C（cyto C）等细胞死亡因子；成熟的 cyto C是维持线粒体呼吸链重要成分。在凋亡诱导因素作用下 , cyto C释放入胞浆，与凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1），半胱氨酸蛋白酶-9 (caspase-9) 前体形成凋亡小体“apoptosome”，并在 dATP 辅助下，激活 caspase-9。caspase-9再酶解 caspase-3前体 , 释放出C末端小肽片段，从而活化caspase-3，活化的caspase-3再级联激活caspase-2、6、8、10等，这些激活的 caspase 最终激活脱氧核糖核酸酶（CAD/DFF45），水解核酸及细胞骨架蛋白，引起细胞
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凋亡。[34]（图4-2）。因此caspase-9是细胞线粒体依赖的凋亡途径中重要起始因子。实验结果表明NW-101作用后细胞内caspase-9水平下降，而凋亡执行者caspase-3前体水平下降，降解片段增加，标志着线粒体途径凋亡的发生。
Caspase抑制剂z-VAD-fmk是一种可以穿透细胞膜的泛Caspase抑制剂(Cell permeable pan caspase inhibitor)，可以抑制由Caspase激活导致的细胞凋亡。实验中我们发现用z-VAD-fmk预孵育HL-60能够完全逆转NW-101诱导的凋亡，说明后者是通过caspase依赖的途径诱导凋亡的。
图4-2 Caspase家族蛋白在线粒体途径介导的凋亡中的作用
X-连锁凋亡抑制蛋白(X-linked Inhibitor of Apoptosis，XIAP)属于IAP家族，其分子结构内有两个特征性的结构域：一个是BIR结构域，它是IAP家族蛋白的特征性结构，位于N末端；另一个是 RING锌指结构域(RING Zn Finger)，位于 XIAP的C末端，包含E3泛素连接酶活性，通过泛素蛋白酶体途径可促进XIAP自身或与其相互作用的蛋白分子泛素化[35]。XIAP通过BIR结构域与caspase-3、-7、-9结合并抑制其活性，同时其RING锌指结构域的E3泛素连接酶活性可降解caspase，从而抑制caspase引起的凋亡。此外XIAP还可以通过降解IκB释放出转录因子蛋白NF-κB，后者入核引起抗凋亡
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基因的表达。Western Blotting结果表明NW-101作用后HL-60细胞内XIAP水平下降，从而增强凋亡。
作为常见的癌基因家族，Bcl-2在肿瘤细胞的凋亡中起着至关重要的作用。Bcl-2家族成员众多，从两个相反的方面调控着细胞的凋亡过程。按照其功能与结构特点，可分为以下三类：多结构域抗凋亡蛋白（Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1、Bfl-1/A1）、多结构域促凋亡蛋白（Bax、Bak）以及BH3-only促凋亡蛋白（Bid、Bim、Bad、Bik、Noxa、PUMA、Bmf、Hrk）。
线粒体外膜上有许多Bcl-2 蛋白家族。蛋白质三级结构分析显示，它们具有成孔道的结构域，Bcl-xL、Bcl-2、Bax、Bid等均可结合到人工膜上，形成离子通道。在细胞存活状态下，Bax 以BH 3结构域与Bcl-2及Bcl-xL的BH3结构域形成异质二聚体。当细胞内Bax类型的BH 3结构域增多时，如在星状孢子staurosporin刺激下Bax高表达，或注入单纯的Bax BH 3结构域，或Bid、Bak、Bad等表达增多，都能使Bax从异二聚体中解离出来，从胞浆转位至线粒体外膜上，引起促凋亡因子释放[36]。Bax与Bcl-2形成异源二聚体时则实现了Bcl-2抑制细胞凋亡的功能[37]。Bcl-2如在线粒体外膜上高表达，一方面与 Bid、Bax结合，抑制cyto C释放的正反馈机制；另一方面，它有“质子泵”的功能 ,使线粒体内呼吸产生的H+外泵至胞浆，维持跨膜电位ΔΨm，减少ROS生成，抑制凋亡。因此Bax与Bcl-2的比值可作为药物引起凋亡的一个重要指标。当细胞内Bax/Bcl-2比值增加时细胞色素C的释放增加，反之则细胞色素C的释放减少。我们发现给药后Bcl-2水平没有明显变化，而Bax水平上升，提示NW-101可能通过影响Bcl-2家族蛋白的表达引起凋亡。
另一方面，我们发现在较低浓度下苯达莫司汀与NW-101引起明显的G2/M期细胞周期阻滞。80 μM苯达莫司汀和1.2 μM NW-101作用HL-60细胞24 h后，细胞G2/M期比例分别为42.86%及45.04%，相比对照组（15.67%）有了明显提高。周期阻滞使受到损伤的细胞分裂停滞，提供了损伤修复的时间，从而可能保护细胞免受细胞毒试剂诱导的凋亡影响，一个重要的例子是p21检验点状态不同的人结肠癌细胞。具有野生型p21的细胞受到γ射线的放射处理后将出现细胞周期阻滞，继而可观察到克隆源性存活（clonogenic survival）；而缺失p21的细胞在接受同样处理后并无周期阻滞发生，从而经历凋亡[38]。周期阻滞对细胞的保护作用在药物临床合用[39]及低氧条件下[40]均可被观察到，也是药物合用策略需要考虑的一个重要方面。
目前对于苯达莫司汀诱导周期阻滞的研究主要集中于咖啡因敏感级联（ATM-Chk2- Cdc25A）。ATM (毛细血管扩张性共济失调症突变激酶)及ATR（(毛细血管扩张性共济失调症及Rad3相关激酶)被认为在DNA损伤引起的信号中扮演着重要角色。ATM和ATR能够分别磷酸化并激活Chk2和Chk1，进而通过在Tyr162位点磷酸化并抑制Cdc25C。失活的Cdc25C无法活化MPF（M期促发因子），导致周期阻滞的发生。有报道证明，苯达莫司汀作用于多发性骨髓瘤细胞后引起的周期阻滞是通过激活ATM-Chk2
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1 前言
急性髓细胞白血病(acute myelocytic leukemia，AML) 或急性非淋巴细胞白血病(ANLL)包括所有非淋巴细胞来源的急性白血病，，全球每年约有20万新发病例。它是多能干细胞或已轻度分化的前体细胞核型发生突变所形成的一类疾病，是造血系统的克隆性恶性疾病。人群接受大剂量放射线或长期接触苯可增加这类疾病的发病率。AML是一个具有高度异质性的疾病群，它可以由正常髓系细胞分化发育过程中不同阶段的造血祖细胞恶性变转化而来，起源于不同阶段祖细胞的AML具有不同的生物学特征。根据细胞形态学和组织化学特征将AML分为不同的类型，如FAB分型中M0～M7型。随着免疫学、细胞遗传学和分子生物学等技术的应用，对AML肿瘤细胞的生物学特性有了更深入的认识和了解，为AML的精确分型、诊断预后和最佳治疗方法的选择奠定了基础。对于AML的治疗除急性早幼粒细胞白血病外仍以联合化疗为主，AML患者总的完全缓解率仅50%～70%，长期无病生存率为25%～30%。
生物烷化剂于19世纪40年代初首次用于治疗肿瘤，之后成为使用最早和最广泛的抗肿瘤化疗药物。各种高效低毒的烷化剂相继开发，并用于固体肿瘤和血液病的治疗。烷化剂在酶系作用后，经过代谢活化，产生有致癌活性的亲电子化合物。代谢产物很容易与生物体中大分子尤其是DNA的亲核位点起反应，与之共价结合，从而影响细胞的代谢和功能，最终导致细胞死亡[1]。烷化剂按化学结构可分为氮芥类、乙撑亚胺类、磺酸酯及多元醇类、亚硝基脲类、三氮烯咪唑类和肼类。氮芥类烷化剂是一种双功能烷化剂，含有的双氯乙基能够与DNA单链、双链结合，造成DNA单链、双链的断裂及双链交联（图1-1），造成DNA损伤，从而破坏其复制及转录功能，产生细胞毒作用[2]。目前临床使用的氮芥类烷化剂有环磷酰胺、美法仑、苯达莫司汀等，主要用于慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤等白血病的治疗[2,3]。
对烷化剂早期的抗肿瘤作用研究主要集中于其烷化作用上。之后随着在临床上的广泛应用，烷化剂严重的耐药性使研究人员开始关注烷化剂耐药性的机制，并基于此基础上尝试了药物合用等新的临床疗法。近年来随着肿瘤分子生物学理论的不断完善，研究人员开始从凋亡和细胞周期阻滞等方面研究烷化剂除了传统的烷化作用之外的其他作用机制，以期为临床使用以及药物研发提供依据。
虽然各种烷化剂的基本烷化作用机制相同，但是各种药物引起DNA烷化形式以及烷化活性则各不相同。环磷酰胺烷化作用的67%是引起磷酸三酯的单烷基化，26%是N-7-鸟嘌呤的单烷基化以及6.7%是N-7-鸟嘌呤-N-7-鸟氨酸的双烷基化[4]。美法兰的烷化作用则是形成约38% 的N-7-鸟嘌呤的单烷基化，20% N-3-腺嘌呤的单烷基化，20% N-7-鸟嘌呤-N-7-鸟嘌呤的双烷基化以及13% N-3-腺嘌呤-N-7-鸟嘌呤的双烷基化[5]。以上实验结果显示，该类烷化剂引起的DNA双链交联只占其烷化作用的一部分，这可能是由于DNA双链交联需要烷化剂与DNA首先形成单加成物，而大多数药物只能引起
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一部分单加成物进而继续形成双加成物导致DNA双链交联[6]。但是DNA双链交联的程度与氮芥类烷化剂的毒性强度有密切关系[7]，被认为是该类烷化剂细胞毒作用的决定性因素[8,9]。
图1-1 氮芥类双功能烷化剂的作用机理
最近的研究则在基因水平深入探讨烷化剂诱导的DNA损伤及修复过程。有文献报道[10]，氮芥类烷化剂引起的DNA损伤有基因特异性，其引起的DNA单加成物以及双链交联的形成会在p53和N-ras这两个基因上迅速累积出现。并且DNA的修复水平与损伤的基因的转录活性以及局部染色体结构的疏密程度密切相关[10,11]，对于转录活性不同的四个基因，氮芥类烷化剂引起损伤后DNA的修复程度为β-actin＞ p53＞ N-ras＞ d-globin ，这一顺序与各基因的转录活性强弱（β-actin＞ p53＞ N-ras＞ d-globin）一致。另外基因染色体结构对修复过程也有重要影响，染色体越疏松，越开放，该基因即产生越有效的DNA修复。最近的临床研究将美法兰在某些基因（如p53）引起的DNA损伤和修复水平的强弱作为白血病临床预后的指标[12]，对于高剂量美法兰疗法（HDM），体外原代白血病细胞DNA损伤程度越高而修复速度越慢，则患者的临床预后越好，这一研究为治疗提供方法从而挑选出对HDM高敏感性的患者，使该疗法更加有效。
肿瘤细胞对于氮芥类烷化剂的耐药性是其长期单独用于治疗的主要障碍。其耐药性的产生主要是由于药物转运活性的改变[13]，烷化剂诱导DNA双链交联动力学的改变[14]，细胞质内GSH/GST将氯乙基烷化基代谢为羟乙基的非活性形式[15]，金属硫因的过表达
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导致对顺铂的耐药性以及对美法兰的交叉耐药性[16]，细胞凋亡水平的改变[17]以及DNA修复活性的增强[18]。
各种DNA修复通路的改变对药物细胞毒性和耐药性起关键作用[19]。氮芥类烷化剂引起的DNA单烷基化损伤主要通过碱基切除修复（BER）和核苷切除修复（NER）通路进行修复，而对DNA双链交联的修复则包括NER、同源性和非同源性重组等多种修复方式[20]。相关文献报道[21]，同源性重组修复（HRR）对于美法兰、苯丁酸氮芥诱导的耐药性起重要作用，这一过程中，修复相关蛋白如HsRad51与Xrcc3高表达，并且HRR蛋白如ERCC-1、XPF、Xrcc2或Xrcc3的基因突变将使细胞对氮芥类烷化剂产生高敏感性。
克服氮芥类烷化剂耐药性的药物包括细胞色素P450的诱导剂，DNA修复过程的调节剂，编码各种酶和信号通路蛋白的基因的反义寡聚核苷酸，以及新型的基因传导系统等，其中一些药物正用于三期临床实验[22]。
苯达莫司汀（Bendamustine，BDM，结构见图1-2）是东德于20世纪60年代开发的氮芥类烷化剂，2003年在德国上市，2008年被FDA批准用于治疗慢性淋巴细胞性白血病[23]和对利妥昔单抗耐药的惰性B细胞非霍奇金淋巴瘤[24]。它主要包括一个双（2-氯乙基）胺的结构和一个苯并咪唑环。双（2-氯乙基）胺可结合DNA及蛋白质，造成单链、双链断裂及双链交联，后者是造成苯达莫司汀细胞毒作用的主要因素。苯并咪唑环可能作为嘌呤类似物以嘌呤和氨基酸代谢拮抗物的方式增强苯达莫司汀的作用，但具体作用至今未能明确。丁酸侧链则增强苯达莫司汀的水溶性。
苯达莫司汀的Ⅲ期临床数据显示，苯达莫司汀/泼尼松的合用方案较标准的美法仑/泼尼松合用在无进展生存率曲线时间、完全缓解率及生活质量上均有较优表现[25]。此外苯达莫司汀与其他烷化剂具有较低的交叉耐药性，因此可作为高剂量美法仑给药后的解救治疗（salvage treatment）。
图1-2 苯达莫司汀化学结构式
根据文献报道，苯达莫司汀作为氮芥类双功能烷化剂，相比于其他烷化剂能够引起更加稳定的双链交联，与DNA的相互作用也更加复杂。它在细胞内可诱导DNA损伤[26]并通过依赖或不依赖p53的途径诱导凋亡[26,27]，并通过咖啡因敏感通路(ATM-Chk2-Cdc2)和ATM-p53-p21途径引起G2/M期阻滞[27]。此外它下调与周期检验点有关的mRNA表达如PLK-1、cyclinB1及极体样激酶1，并诱导非凋亡性细胞死亡，如坏死以及mitotic
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catastrophe[28]。与一般烷化剂诱导烷基转移酶修复机制不同，苯达莫司汀与O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶的抑制剂O6-苄基鸟嘌呤合用，细胞毒性没有明显变化；而与DNA修复酶APE的抑制剂甲氧胺合用，IC50下降约6倍，说明苯达莫司汀诱导的是碱基切除修复途径。值得注意的是，有文献指出在苯达莫司汀合用P38 MAPK抑制剂SB202190可以逆转单用时诱导的周期阻滞，并增强凋亡效果[27]。
化合物NW-101由合作单位合成，是苯达莫司汀经结构修饰所得的双功能烷化剂。在前期的研究中发现NW-101在多种肿瘤细胞株，尤其是在急性髓细胞白血病（AML）细胞HL-60中表现出比苯达莫司汀及其它传统的生物烷化剂如美法仑、苯丁酸氮芥等更强的抗肿瘤效果，并能够有效引起DNA交联。
基于以上基础，本课题旨在探索NW-101在HL-60细胞株中的抗肿瘤作用及相关机制。
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2 材料与方法
2.1试剂
NW-101由合作单位合成，用DMSO配制为4 mM的储备浓度于–20℃保存，临用前稀释。胎牛血清（FBS）购自杭州四季青生物工程材料有限公司，新生牛血清（NBCS）购自浙江天杭生物科技有限公司；RPMI 1640培养液粉末购自上海世仪生物科技有限公司；Western-Blotting检测试剂ECL购自Amersham Biosciences公司。纯乙醇、DMSO购自浙江杭州双林化工试剂厂。脱脂奶粉购自光明乳业有限公司。caspase-3抑制剂z-VAD-fmk购自B&D，用DMSO配制成10 ?M于-20 ℃避光保存。
PMSF、aprotinin、leupeptin、NP40、Triton-100、丙烯酰胺、双丙烯酰胺、Tris、甘氨酸均为上海生工生物工程产品；四唑盐（MTT）为Amresco分装产品，临用前用PBS磷酸盐缓冲液溶解，终浓度为5 mg/ml；Procaspase-3、cleaved-caspase-3、caspase-8、procaspase-9、Bcl-2、Bax、Bid、PARP、XIAP、p38、p-JNK、JNK、β-Actin及辣根过氧化物酶标记的anti-mouse、anti-goat、anti-rabbilt抗体均购自Santa Cruz公司；p-p38抗体购自Cell Signaling Technology公司；ECL为Pierce公司产品；Maker （#SM1811） 为Fermentas公司产品。
以下试剂自行配制：
(1) PBS：8 g NaCl，0.2 g KCl，0.24 g KH2PO4，3.58 g Na2PO4?12H2O，1 L H2O (2) T-PBS：含0.1% Tween20的PBS。
(3) 细胞裂解液：分别将0.1 M PMSF 1 ?l，0.1 M NaVO41 ?l，2mg/ml Leupeptin 2.5 ?l，Triton-100 2 ?l，NP40 3 ?l 加入到1 ml IP Buffer中，涡旋混匀后使用。
(4) 低渗裂解液：10 mM Tris PH=7.4，1 mM EDTA，0.2% Triton100。 (5) TE Buffer：1 mM EDTA，10 mM Tris-HCl PH=8.0。
(6) Running Buffer：Tris 3. 03 g，Glycine 13.73 g，20% SDS 5 ml，1 L H2O。 (7) Transfer Buffer：25 mM Tris base，0.2 M glycine，20% methanol。
(8) 12%分离胶：A液 3 ml，B液 1.875 ml，DDW 2.625 ml，10% AP 37.5 ?l，TEMED 3.75 ?l。
10%分离胶：A液 2.5 ml，B液 1.875 ml，DDW 3.128 ml，10% AP 37.5 ?l，TEMED 7.5 ?l。
5%浓缩胶：A液 0.415 ml，C液 0.625 ml，DDW 1.4375 ml，10% AP 18.75 ?l，TEMED 3.125 ?l。
A液：丙烯酰胺29.2 g，双丙烯酰胺0.8 g，加蒸馏水到100 ml，4℃储藏。 B液：2 mol/L Tris-HCl(PH 6.8) 75 ml，10% SDS 4 ml，蒸馏水21 ml，4℃储藏。 C液：1 mol/L Tris-HCl 50 ml，10% SDS 4 ml，蒸馏水6 ml，4 ℃储藏。
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2.2 器材
层流超净工作站（1851型，Thermo Electron公司）；二氧化碳细胞培养箱（3111型，Thermo Electron公司）；倒置显微镜（DMIL型，德国LEICA）；高速离心机（Centrifuge 5702，Eppendorf公司）；台式高速低温离心机（Centrifuge 5415R，Eppendorf公司）；恒温水浴箱（型号：DK-S11型，上海森信实验仪器有限公司）；旋涡混合器（型号：vortex genus 3，IKA?）；恒温振荡器（HZ-9212S，太仓市科教器材厂）；核酸蛋白测定仪（NANODROP 1000，Thermo）；电泳仪（DYCZ-24型，北京市六一仪器厂）；细胞培养瓶和6孔、24孔、96孔细胞培养板（Falcon）；医用胶片（柯达）；冰箱（MEDICOLL/BIOMEDICAC FREEZER，SANYO）。
2.3细胞培养
本实验采用的人急性髓细胞白血病细胞株HL-60购自中国科学院上海细胞生物学研究所。上述细胞株使用含100 U/ml青霉素和100 ?g/ml链霉素的RPMI 1640培养液加上10%胎牛血清，在37 ℃、5% CO2及饱和湿度环境中培养。
2.4 细胞冻存及复苏
取对数期生长的HL-60细胞，离心后加入冻存液（10% DMSO、20% FBS及70% RPMI-1640培养液），以50-100万细胞每毫升的密度分装于冻存管中（每管2 mL）。冻存管在4℃冰箱中放置30 min后置于-20℃冰箱中2 h，-80℃过夜后保存在液氮中。加入冻存液时应最后滴加DMSO并不断摇晃，避免DMSO溶解放热对细胞造成伤害。
自液氮中取出冻存管，迅速置于37℃水浴中，在1 min内融化。将含细胞的冻存液加入FBS浓度20%的培养液中，离心，细胞加入含20?S的培养液中，置于37℃、5% CO2及饱和湿度环境中培养。
2.5 MTT法检测NW-101的细胞毒性
取对数期生长的HL-60细胞，以4000细胞每孔的密度接种于96孔板，每孔200 μL，置于CO2培养箱中过夜。加入终浓度为0-4μM的NW-101，并以等量DMSO作为溶媒对照。作用72 h后加入PBS配制的5 mg/mL MTT溶液，每孔20 μL，继续作用4-6 h后小心吸弃上清液，每孔加入100 μL DMSO溶解甲瓒沉淀，振荡后用酶标仪在570 nm处检测吸光度 (OD值)，计算半数抑制浓度IC50：
抑制率(IR %) = (1-TOD/COD) × 100%，其中TOD为给药组OD 均值，COD为溶剂对照组OD 均值。用LOGIT法求出IC50。
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2.6 流式细胞术检测细胞凋亡及周期阻滞
药物作用后的HL-60细胞1400 rpm离心5 min，之后细胞用冷PBS洗一遍并用75%乙醇固定，固定2 h后的细胞1400 rpm离心5 min，冷PBS洗一遍后重悬于500 ?l PBS中并加入5 ?l RNase，置于培养箱中消化30 min后加入5 ?l PI染液，室温避光染色30 min，用流式细胞仪检测细胞凋亡及周期阻滞情况。
2.7 流式细胞术检测细胞内ROS生成情况
药物作用后的HL-60细胞1400 rpm离心5 min，之后细胞用冷PBS洗一遍并再次离心，DCFH-DA：PBS=1:1000稀释后重悬细胞，37℃避光孵育30min。离心后PBS洗去多余染料，离心后重悬，用流式细胞仪检测细胞内荧光表达情况。
2.8 Western-blotting法检测相关蛋白
2.8.1 收集细胞
取对数生长期HL-60细胞，约1×105 /ml种瓶。加入终浓度为4 μM或1.2 ?M的NW-101，作用一定时间后收集细胞。 2.8.2蛋白提取及标定
配制细胞裂解液RIPA buffer，每管各加入80 ?L，吹打均匀。每10 min混匀一次，30 min后13200 rpm、4 ℃离心30 min，取上清即为蛋白溶液。以上过程需在冰上操作。采用280nm光吸收法测定蛋白含量，并将样本蛋白溶液分装，-80 ℃保存。 2.8.3 制胶
根据2.1中配方制备10％和12%的分离胶，加入经预冷的玻璃内，水封，凝固后加入5％的浓缩胶，插入1.5 mm梳子，凝固后置于4 ℃过夜。注意避免SDS-Page出现气泡。 2.8.4 电泳
将分装好的蛋白补加三蒸水和loading buffer （5×） 至相同体积（控制在10-30 ml），煮沸5 min使蛋白变性，上样。1×Running buffer电泳，先70V，30 min，待样本跑至浓缩胶和分离胶交界处时，改为110 V，90 min。 2.8.5 转膜
PVDF膜（0.45）用甲醇预处理10秒， 1×Transfer buffer 浸泡15 min，板（黑色）－纤维棉－滤纸－胶－膜－滤纸－纤维棉－板（红色）的顺序安装，转膜60 min，电流为330 mA，转移槽置于冰水浴中。 2.8.6 封闭
苯达莫司汀结构改造物NW-101在AML细胞HL-60中的作用及机制 8
5% (w/v)脱脂奶粉，1×TPBS(0.1% Tween-20)，室温下，孵育1 h（置于摇床，缓慢摇晃）。 2.8.7孵育抗体
用5% (w/v)脱脂奶粉1:500稀释的一抗室温孵育3 h，1×TPBS洗3遍，分别是15 min，5 min和5 min；再用1:5000的辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1h，同上法洗3遍。 2.8.8曝光
ECL试剂盒A液和B液以1:1混合，滴于干净玻璃纸上，将膜用吸水纸吸干，正面向着ECL混合液，孵育1 min，放于曝光盒中，进入暗室，在膜的位置上覆盖上X光胶片，曝光后，取出胶片，置于曝光机中显影定影并烘干。
2.9 DAPI染色观察细胞核形态
收取细胞离心，PBS洗多次，将DAPI储存液与加有0.1% Triton的PBS按1:1000的比例稀释，重悬细胞并作用1 min后离心，PBS洗多次，重悬后于96孔板中置于荧光显微镜下观察。
苯达莫司汀结构改造物NW-101在AML细胞HL-60中的作用及机制 9
3 实验结果
3.1 NW-101在HL-60细胞上表现出较强的生长抑制作用
NW-101作用于HL-60细胞后表现出明显的生长抑制作用作用，并呈现剂量依赖性（图3-1）。MTT法测得其72 h的半数抑制浓度（IC50值）为0.47 μM，95%置信区间为0.37-0.60 μM，相比其母体化合物苯达莫斯汀的IC50值（14.68 μM）有更强的细胞毒作用。
图3-1 不同浓度NW-101作用于HL-60细胞72 h后引起剂量依赖的生长抑制效应
3.2 NW-101诱导HL-60细胞凋亡
0-4 μM NW-101作用于HL-60细胞24 h后进行PI单染，流式细胞术观察凋亡情况（图3-2）。NW-101诱导的细胞凋亡率随给药浓度的升高而逐渐升高，在浓度为4 μM时，HL-60细胞凋亡率为68.26%，与阳性药物美法仑给药浓度为20 μM（64.96%）时作用相当。
苯达莫司汀结构改造物NW-101在AML细胞HL-60中的作用及机制 10
图3-2 不同浓度NW-101及美法仑作用于HL-60细胞24 h后引起细胞凋亡
根据上述量效的结果，选用4 μM的NW-101分别作用0、6、12、18、24 h后观察药物诱导细胞凋亡与作用时间的关系。流式结果显示NW-101作用后HL-60细胞的凋亡率表现出明显的时间依赖性（图3-3）。作用6、12、18、24 h后，细胞凋亡率分别为1.65%、11.16%、44.2%、68.26%。上述结果表明，NW-101能够引起细胞凋亡，并且呈现剂量和时间的依赖性。
图3-3 NW-101作用于HL-60细胞一定时间后引起的细胞凋亡
3.3 NW-101诱导HL-60凋亡相关蛋白的表达
为了考察NW-101引起HL-60细胞凋亡的相关机制，我们检测了4 μM NW-101作用0、6、12、18、24 h后对凋亡相关蛋白表达水平的影响。首先我们检测了caspase通路相关蛋白的表达（图3-4）。该浓度下随着药物作用时间的增加，procaspase8蛋白水平逐步下降，6 h时出现裂解片段，之后裂解的caspase8水平逐渐上升。裂解活化的caspase8剪切细胞质中的Bid，导致Bid的蛋白水平降低；同时procaspase9也表现出下降的趋势。NW-101作用12 h时出现caspase3的裂解片段，作用24 h后几乎所有caspase3均被裂解激活。PARP的蛋白酶解作为半胱氨酸蛋白酶激活的分子事件，被认为是细胞程序死亡的一个早期分子标志[29]。随着作用时间的延长，原长为116 kDa的PARP逐渐被裂解
苯达莫司汀结构改造物NW-101在AML细胞HL-60中的作用及机制 11
为89 kDa的片段。相应地，凋亡抑制蛋白XIAP的表达水平则逐渐降低。阳性药物美法仑20 μM作用12、24 h对上述蛋白的影响结果与NW-101相似。随后我们检测了NW-101对Bcl-2家族蛋白表达的影响。结果显示抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平没有明显变化，而促凋亡蛋白Bax则呈时间依赖性地累积，且Bax/Bcl-2比值逐渐升高。与NW-101不同，美法仑对Bax，Bcl-2的表达以及Bax/Bcl-2比值均没有明显的影响。
图3-4 NW-101作用于HL-60细胞一定时间后引起凋亡相关蛋白表达改变
3.4 Caspase抑制剂可逆转NW-101诱导的凋亡
为了从另一方面说明NW-101诱导HL-60细胞凋亡的机制，在给药前使用泛caspase抑制剂z-VAD-fmk预孵育细胞1 h，PI染色测定给药后不同时间的细胞死亡率（图3-5），结果发现加入z-VAD-fmk的给药组细胞死亡率和对照组相近，明显低于未加入z-VAD-fmk的给药组死亡率。光镜下观察，4 μM NW-101作用18 h后开始出现细胞碎片，作用24 h后可见细胞周围围绕有多个凋亡小体，细胞体积变小、皱缩，而合用z-VAD-fmk的细胞则无此现象（图3-6）。
苯达莫司汀结构改造物NW-101在AML细胞HL-60中的作用及机制 12
图3-5 NW-101与z-VAD-fmk作用后的细胞死亡率
图3-6 NW-101与z-VAD-fmk作用后的细胞形态
DAPI染色后荧光显微镜下观察细胞核形态。在未加入z-VAD-fmk的细胞中，4 μM NW-101作用24 h后可见明显的核碎片及凋亡小体；而加入z-VAD-fmk预孵育后给药的细胞可见核碎片和凋亡小体的数量明显减少（图3-7）。以上实验结果证实z-VAD-fmk能够有效逆转NW-101诱导的凋亡。
苯达莫司汀结构改造物NW-101在AML细胞HL-60中的作用及机制 13
z-VAD-fmk-+ControlNW-1014 μM,24 h10X20X
图3-7 NW-101与z-VAD-fmk作用后的细胞核形态
3.5 NW-101引起剂量及时间依赖性的G2/M期阻滞
为了考察较低浓度下NW-101对细胞周期的影响，选用0-1.2 μM NW-101作用HL-60一定时间。给药后细胞表现出明显的G2/M期阻滞，并呈现剂量与时间依赖性（图3-8、图3-9）。其中对照组G2/M期比例为15.67±1.11，1.2 ?M NW-101作用24 h后G2/M期比例为47.585±0.77，相对增加了203.67%；给药后G0/G1期比例相对对照组有了较大下降。药物作用后12 h以内主要表现为S期阻滞，24 h后出现明显的G2/M期阻滞。同时需要指出的是，在以上实验条件下药物引起的细胞凋亡比例较低。
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6050G0/G1SG2/MPropertage4030201000.0.2.4.6.81.01.2Concentration of NW-101 (μM)
图3-8 NW-101不同剂量给药作用HL-60细胞24h后细胞周期比例
G0/G1SG2/MconNW-101 1 h10080NW-101 3 hNW-101 6 hPropertage604020NW-101 12 hNW-101 24 h0136Time (h)1224
图3-9 NW-101（1.2 μM）作用不同时间后细胞周期比例
3.6 NW-101在HL-60细胞株中引起的周期阻滞可被Caffeine逆转
我们用2mM的ATM/ATR抑制剂caffeine预孵育HL-60细胞30 min后给药作用24 h，考察caffeine对NW-101引起的G2/M期阻滞的影响。流式细胞术的结果显示（图3-10），caffeine可部分逆转NW-101引起的周期阻滞（G2/M期比例由40.33%降为23.65%，对照组G2/M期细胞比例为12.46%），并增强凋亡效果（凋亡率由16.14%上升至22.68%，对照组凋亡率为3.31%）。
苯达莫司汀结构改造物NW-101在AML细胞HL-60中的作用及机制 15
7060G0/G1SG2/MApoPropertage50403020100CaffeineNW-101--+--+++ 图3-10 NW-101与Caffeine对细胞周期及凋亡的影响
此外免疫印迹分析发现NW-101作用后磷酸化的chk2蛋白上调，而磷酸化的chk1蛋白水平没有明显变化，说明NW-101是通过ATM/ATR-Chk2途径引起G2/M期阻滞的（图3-11）。
NW-101 (1.2 ?M) 0 1 3 6 12 24 hP-Chk1P-Chk2GAPDH图3-11 NW-101引起Chk1/2磷酸化水平的变化
3.7 NW-101在HL-60细胞株中上调p38及ERK的磷酸化水平
NW-101作用HL-60细胞0、1、3、6、12、24 h后收取细胞进行免疫印迹分析，发现给药后磷酸化p38及ERK蛋白水平上升，而JNK磷酸化水平未发生改变（图3-12）。说明NW-101引起的G2/M期阻滞可能涉及到p38 MAPK及ERK这两条MAPK并行通路的激活。
苯达莫司汀结构改造物NW-101在AML细胞HL-60中的作用及机制 21
实现的，并且在这一过程中Cdc25C的磷酸化水平没有发生改变，而能够激活Cdc2和cdk2的Cdc25A在苯达莫司汀给药后发生了下调[27]。
为了考察ATM/ATR通路在NW-101引起的G2/M期阻滞中的作用，我们分析了预孵育ATM/ATR激酶抑制剂caffeine后NW-101作用下HL-60的周期阻滞情况。Caffeine与NW-101合用时G2/M期比例为23.56%，相比NW-101单用时的40.33%有了一定的下降，但相比阴性对照组（12.46%）仍表现出一定影响。Caffeine在部分逆转了低浓度NW-101引起的G2/M期阻滞的同时，在一定程度上增强了后者的凋亡效果（合用时凋亡比例为22.68%，NW-101单用时凋亡比例为16.14%）。这一现象说明NW-101给药后引起的周期阻滞，实质上是细胞对DNA损伤应激的一种保护机制，而逆转药物引起的周期阻滞可能是增强药物临床作用的一个有效手段。同时免疫印迹结果也显示NW-101作用后p-Chk2的蛋白水平发生上调，提示NW-101与其母体化合物苯达莫司汀一样，是通过ATM/ATR-Chk2途径诱导G2/M期阻滞的。
由于对ATM/ATR的抑制并不能完全逆转NW-101引起的周期阻滞，我们分析可能在细胞内存在着介导阻滞的其他途径。包括p38 MAPK、ERK及JNK在内的MAPK并行通路在G0/G1及G2/M期阻滞中常常扮演重要作用，因此我们考察了相关蛋白在给药后的表达情况。
P38 MAPK是MAPKs的亚类之一，其信号通路由三级激酶链组成，上游激活物为MKK3、MKK4和MKK6。此外并行MAPKs信号通路还包括ERK信号通路和JNK/SAPK通路。细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路最早被确立，也是经典的MAPKs信号通路，主要包括ERKl和ERK2，两种蛋白在各种组织中均有表达，主要传递细胞有丝分裂原信号，参与调节细胞周期及促进细胞增殖分化；第二条被发现的MAPKs通路是JNK通路，主要受各种细胞应激反应和致炎因子的激活，包括JNKl、JNK2和JNK3三种亚型，前两种JNK在各种组织中广泛表达，而JNK3则主要表达于脑组织中；第三条被发现的MAPKs通路是p38蛋白激酶通路，可被紫外线、细胞外高渗、H2O2、热休克等细胞外应激激活。它们是迄今为止人们认识的最重要的细胞分裂调节系统，多种细胞的周期调控与MAPKs活性有关，MAPKs存在于大多数细胞内，在将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内，并引起细胞生物学反应（如细胞增殖、分化、转化及凋亡等）的过程中具有重要作用。不同的细胞外刺激可使用不同的MAPKs信号通路，通过其相互调控而介导不同的细胞生物学反应[28]。MAPKs通常处于胞浆信号转导通路的终末位置，活化后转位到核内，作用于核内的转录因子，调节基因表达。
有文献报道p38 MAPK通路在G0/G1期阻滞及G2/M期阻滞中发挥着作用。P38 MAPK对G1期的阻滞是通过调控相关底物HBP1和p21来实现的[41,42]；P38 MAPK的激活还引起哺乳动物细胞M期阻滞，并与UV及异黄酮类物质引起的G2周期阻滞密切相关[43,44]。另外，ERK在DNA损伤引起的周期阻滞及凋亡过程中也发挥着重要作用，有报道依托泊苷作用NIH3T3后引起的G2/M期阻滞是ERK介导的，且ERK的活化与
苯达莫司汀结构改造物NW-101在AML细胞HL-60中的作用及机制 22
ATM/ATR有关[45]。
实验结果证实在NW-101作用后细胞内的p38 MAPK及ERK通路被激活，进而可能通过活化下游蛋白实现G2/M期阻滞。
近期有文献认为，活性氧簇（ROS）可能作为细胞内信号因子对信号通路进行调控
[46,47]
，胞内ROS水平受细胞因子、生长因子和受体激动剂的影响而发生改变，当ROS
水平超过胞内保护系统的调节能力时就会发生氧化应激，从而导致DNA损伤、蛋白修饰及其他胞内反应，而多种蛋白激酶和转录调控因子也在氧化应激条件下被激活。
我们检测了低浓度NW-101给药后0-6 h的ROS水平，发现给药组胞内ROS水平相对对照组没有明显改变。这基本上排除了NW-101通过产生活性氧簇激活p38 MAPK通路引起G2/M期阻滞的可能。
综上所述，NW-101作为苯达莫司汀的结构改造物，在急性髓细胞白血病细胞HL-60上具有较强的细胞毒作用。其诱导的凋亡可能是通过死亡受体途径和Bcl-2家族蛋白调控的线粒体依赖性途径介导凋亡，进而通过caspase级联的激活放大凋亡效应。另一方面NW-101在细胞中主要引起G2/M期阻滞，这一过程与ATM/ATR通路有关，是细胞在DNA损伤应激下的一种保护措施。
在之后的研究中，我们希望能够对p38 MAPK及ERK在NW-101诱导周期阻滞过程中的作用做进一步验证，利用p38抑制剂SB203580及ERK上游的MEK1抑制剂PD98059尝试逆转NW-101引起的G2/M期阻滞，以期进一步探索NW-101引起G2/M期阻滞的具体机制。
苯达莫司汀作为一个兼具双功能烷化基团和抗代谢基团的药物，在恶性肿瘤的临床治疗中发挥着重要作用。NW-101是苯达莫司汀的结构改造物，经我们实验证明在白血病细胞HL-60中表现出优于苯达莫司汀的良好活性。得到的数据证明，NW-101能够通过死亡受体途径和线粒体依赖性途径引起caspase依赖性的凋亡，且凋亡过程与Bcl-2家族促凋亡蛋白的上调有关；同时低剂量NW-101在细胞内引起ATM/ATR-Chk2及p38 MAPK/ERK通路共同介导的G2/M期阻滞，这一现象实质上是细胞的一种自我保护，逆转阻滞将增强药物的凋亡效果。P38 MAPK通路的激活与ROS无关。
在以上实验结论的基础上，我们认为通过药物逆转NW-101的周期阻滞或针对性地靶定于NW-101作用后的G2/M期细胞，可能是强化药物临床效果的一个可行途径。
苯达莫司汀结构改造物NW-101在AML细胞HL-60中的作用及机制 23
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苯达莫司汀结构改造物NW-101在AML细胞HL-60中的作用及机制 27
致谢
在论文即将完成之际，我怀着最诚挚的心情向浙江大学药学院肿瘤与内分泌药理实验室的杨波和何俏军两位老师表示感谢。两位老师对我在本次研究的选题、文献资料的查询、实验具体实施等方面给予了我诸多指点，在学习生活中给予了我关怀与鼓励，使我逐渐从一个药理学的“门外汉”一步步成长起来。对于两位老师的指导与帮助，在此我再次表示深深感谢！
在此次课题研究过程中，得到了浙江大学药学院肿瘤与内分泌药理实验室各位师兄及同学的无私帮助，在此，向他们表示诚挚的谢意！在这里我尤其要感谢我的师兄曹戟，他严谨务实的科研态度和勤恳耐劳的实验素质留给了我很深的印象，为我树立了研究生时期学习的榜样；同时还要感谢和我一道完成实验的各位低氧组同学，在我遇到困难时给予我无私的帮助。
感谢华东理工大学药学院老师和同学在论文完成过程中给予的大力配合、支持和真诚帮助。感谢我在药理学和分子生物学的启蒙老师刘建文教授和杨弋教授，他们的教导引导我走上了肿瘤药理学研究的道路。感谢我的校内指导老师侯志安教授，在论文写作方面给予我的无私指导。
最后衷心的感谢我的父母及家人，是他们给我提供了一个良好的学习环境，帮助我完成了我的学业！
