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细胞工程、胚胎工程、克隆技术
基础知识
（一）植物细胞工程
1.理论基础（原理）：细胞全能性
全能性表达的难易程度：受精卵＞生殖细胞＞干细胞＞体细胞；植物细胞＞动物细胞 2.植物组织培养技术
（1）过程：离体的植物器官、组织或细胞 ―→愈伤组织 ―→试管苗 ―→植物体
（2）用途：微型繁殖、作物脱毒、制造人工种子、单倍体育种、细胞产物的工厂化生产。 （3）地位：是培育转基因植物、植物体细胞杂交培育植物新品种的最后一道工序。 3.植物体细胞杂交技术 （1）过程：
（2）诱导融合的方法：物理法包括离心、振动、电刺激等。化学法一般是用聚乙二醇（PEG）作为诱导剂。
（3）意义：克服了远缘杂交不亲和的障碍。
（二）动物细胞工程 1. 动物细胞培养
（1）概念：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然
后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。
（2）动物细胞培养的流程：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）→剪碎
→用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。
（3）细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。细胞数目不断增多，当贴壁细胞
分裂生长到表面相互抑制时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。 （4）动物细胞培养需要满足以下条件
①无菌、无毒的环境：培养液应进行无菌处理。通常还要在培养液中添加一定量的抗生素，以防培养过程中的污染。
此外，应定期更换培养液，防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。
②营养：合成培养基成分：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。通常需加入血清、血浆等天然成分。 ③温度：适宜温度：哺乳动物多是36.5℃＋0.5℃；pH：7.2～7.4。
④气体环境：95%空气＋5%CO2。O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH。
（5）动物细胞培养技术的应用：制备病毒疫苗、制备单克隆抗体、检测有毒物质、培养医学研究的各种细胞。 2.动物体细胞核移植技术和克隆动物
（1）哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞核移植（比较容易）和体细胞核移植（比较难）。
（2）选用去核卵(母)细胞的原因：卵(母)细胞比较大，容易操作；卵(母)细胞细胞质多，营养丰富。
（3）体细胞核移植的大致过程是：（右图）
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胚胎移植 核移植
（4）体细胞核移植技术的应用：
①加速家畜遗传改良进程，促进良畜群繁育； ②保护濒危物种，增大存活数量； ③生产珍贵的医用蛋白； ④作为异种移植的供体； ⑤用于组织器官的移植等。
（5）体细胞核移植技术存在的问题：
克隆动物存在着健康问题、表现出遗传和生理缺陷等。 3.动物细胞融合
（1）动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。融合后形成的具有原来两个或
多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。
（2）动物细胞融合与植物原生质体融合的原理基本相同，诱导动物细胞融合的方法与植物原生质体融合的方法类似，
常用的诱导因素有聚乙二醇、灭活的病毒、电刺激等。
（3）动物细胞融合的意义：克服了远缘杂交的不亲和性，成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物生物新品种培育
的重要手段。
（4）动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较： 比较项目 细胞融合的原理 细胞融合的方法 诱导手段 用法 植物体细细胞膜的流动性 去除细胞壁后诱离心、电刺激、克服了远缘杂交胞杂交 导原生质体融合 振动，聚乙二醇的不亲和性，获得等试剂诱导 杂种植株 动物细胞细胞膜的流动性 使细胞分散后诱除应用植物细制备单克隆抗体融合 导细胞融合 胞杂交手段外，的技术之一 再加灭活的病毒诱导 4.单克隆抗体 （1）抗体：一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。从血清中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差。 （2）单克隆抗体的制备过程： 抗原注入小鼠体内 分离 B淋巴细胞 骨髓瘤细胞 ---------------------------------------------------------精品 文档--------------------------------------------------------------------- 细胞融合 杂交瘤细胞 细胞培养 精品文档就在这里
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（3）杂交瘤细胞的特点：既能大量繁殖，又能产生专一的抗体。 （4）单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，并能大量制备。 （5）单克隆抗体的作用：
① 作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质的细微差异，并跟一定抗原发生特异性结合，具有准确、高效、简易、快速的优点。
② 用于治疗疾病和运载药物：主要用于治疗癌症治疗，可制成“生物导弹”，也有少量用于治疗其它疾病。
专题3 胚胎工程
（一）动物胚胎发育的基本过程
1、胚胎工程是指对动物早期胚胎或配子所进行的多种显微操作和处理技术，如胚胎移植、体外受精、胚胎分割、胚胎干细胞培养等技术。经过处理后获得的胚胎，还需移植到雌性动物体内生产后代，以满足人类的各种需求。 2、动物胚胎发育的基本过程
（1）受精场所是母体的输卵管上段。
（2）卵裂期：特点：细胞有丝分裂，细胞数量不断增加，但胚胎的总体体积并不增加，或略有减小。 （3）桑椹胚：特点：胚胎细胞数目达到32个左右时，胚胎形成致密的细胞团，形似桑椹。是全能细胞。
（4）囊 胚：特点：细胞开始出现分化（该时期细胞的全能性仍比较高）。聚集在胚胎一端个体较大的细胞称为内细
胞团，将来发育成胎儿的各种组织。中间的空腔称为囊胚腔。
（5）原肠胚：特点：有了三胚层的分化，具有囊胚腔和原肠腔。 （二）胚胎干细胞
1、哺乳动物的胚胎干细胞简称ES或EK细胞，来源于早期胚胎或从原始性腺中分离出来。
2、具有胚胎细胞的特性，在形态上表现为体积小，细胞核大，核仁明显；在功能上，具有发育的全能性，可分化为成年动物体内任何一种组织细胞。另外，在体外培养的条件下，可以增殖而不发生分化，可进行冷冻保存，也可进行遗传改造。
3、胚胎干细胞的主要用途是：
①可用于研究哺乳动物个体发生和发育规律；
②是在体外条件下研究细胞分化的理想材料，在培养液中加入分化诱导因子，如牛黄酸等化学物质时，就可以诱导ES细胞向不同类型的组织细胞分化，这为揭示细胞分化和细胞凋亡的机理提供了有效的手段； ③可以用于治疗人类的某些顽疾，如帕金森综合症、少年糖尿病等；
④利用可以被诱导分化形成新的组织细胞的特性，移植ES细胞可使坏死或退化的部位得以修复并恢复正常功能； ⑤随着组织工程技术的发展，通过ES细胞体外诱导分化，定向培育出人造组织器官，用于器官移植，解决供体器官不足和器官移植后免疫排斥的问题。 （三）胚胎工程的应用
1.体外受精和胚胎的早期培养 (1)卵母细胞的采集和培养：
主要方法：用促性腺激素处理，使其排出更多的卵子，然后，从输卵管中冲取卵子，直接与获能的精子在体外受精。
第二种方法：从刚屠宰母畜的卵巢中采集卵母细胞；第三种方法是借助超声波探测仪、腹腔镜等直接从活体动物的卵巢中吸取卵母细胞。采集的卵母细胞，都要在体外经人工培养成熟后，才能与获能的精子受精。
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(2) 精子的采集和获能：在体外受精前，要对精子进行获能处理。
(3) 受精：获能的精子和培养成熟的卵细胞在获能溶液或专用的受精溶液中完成受精过程。
(4)胚胎的早期培养：精子与卵子在体外受精后，应将受精卵移入发育培养液中继续培养，以检查受精状况和受精卵的
发育能力。培养液成分较复杂，除一些无机盐和有机盐外，还需添加维生素、激素、氨基酸、核苷酸等营养成分，以及血清等物质。当胚胎发育到适宜的阶段时，可将其取出向受体移植或冷冻保存。不同动物胚胎移植的时间不同。(牛、羊一般要培育到桑椹胚或囊胚阶段才能进行移植，小鼠、家兔等实验动物可在更早的阶段移植，人的体外受精胚胎可在4个细胞阶段移植。)
2.胚胎移植
(1)胚胎移植是指将雌性动物的早期胚胎，或者通过体外受精及其它方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的其它雌性动物的体内，使之继续发育为新个体的技术。其中提供胚胎的个体称为“供体”，接受胚胎的个体称为“受体”。（供体为优良品种，作为受体的雌性动物应为常见或存量大的品种。）
地位：如转基因、核移植，或体外受精等任何一项胚胎工程技术所生产的胚胎，都必须经过胚胎移植技术才能获得后代，是胚胎工程的最后一道“工序”。
(2) 胚胎移植的意义：大大缩短了供体本身的繁殖周期，充分发挥雌性优良个体的繁殖能力。
(3) 生理学基础：①动物发情排卵后，同种动物的供、受体生殖器官的生理变化是相同的。这就为供体的胚胎移入受体提供了相同的生理环境。
②早期胚胎在一定时间内处于游离状态。这就为胚胎的收集提供了可能。
③受体对移入子宫的外来胚胎不发生免疫排斥反应。这为胚胎在受体的存活提供了可能。
④供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联系，但供体胚胎的遗传特性在孕育过程中不受影响。 (4) 基本程序主要包括：
①对供、受体的选择和处理。选择遗传特性和生产性能优秀的供体，有健康的体质和正常繁殖能力的受体，供体和受体是同一物种。并用激素进行同期发情处理，用促性腺激素对供体母牛做超数排卵处理。 ②配种或人工授精。 ③对胚胎的收集、检查、培养或保存。配种或输精后第7天，用特制的冲卵装置，把供体母牛子宫内的胚胎冲洗出来(也叫冲卵)。对胚胎进行质量检查，此时的胚胎应发育到桑椹或胚囊胚阶段。直接向受体移植或放入－196℃的液氮中保存。
④对胚胎进行移植。
⑤移植后的检查。对受体母牛进行是否妊娠的检查。 3.胚胎分割
(1)概念：是指采用机械方法将早期胚胎切割2等份、4等份等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术。 (2)意义：来自同一胚胎的后代具有相同的遗传物质，属于无性繁殖。
(3)材料：发育良好，形态正常的桑椹胚或囊胚。（桑椹胚至囊胚的发育过程中，细胞开始分化，但其全能性仍很高，
也可用于胚胎分割。）
(4)操作过程：对囊胚阶段的胚胎分割时，要将内细胞团均等分割，否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。
考点分析
1.细胞工程中的一些技术手段的比较 细胞工程 植物细胞工程 动物细胞工程 基本原理 细胞生物学和分子生物学的原理和方法，工程学手段改造细胞 操作水平 细胞整体水平、细胞器水平操作 实质内容 改变遗传物质、产生新的性状，获得细胞产品 动物细胞培养 植物组织培养技术 技术手段 动物细胞融合、单克隆抗体制备技术 植物体细胞融合技术 胚胎移植、核移植等 理论基础 植物细胞全能性、细胞膜的流动性 细胞增值、细胞膜的流动性 诱导手段 物理法 离心、振动、电刺激 物理 电刺激 ---------------------------------------------------------精品 文档--------------------------------------------------------------------- 精品文档就在这里
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化学法 聚乙二醇 化学 聚乙二醇 生物 灭活病毒（灭活仙台病毒） 正常小鼠的处理(注射灭活抗原) 动物细胞融合(物、化、生法) 杂交瘤细胞的筛选和培养 提纯单克隆抗体(特异性强、灵敏度高) 原生质体的制备(酶解法) 原生质体的融合(物、化法) 过 程 杂种细胞的筛选和培养 杂种植株鉴定 应用 白菜—甘兰等杂交植物 单克隆抗体的制备（杂交瘤细胞） 意义和用(1)克服有性远缘杂交不亲和性障碍 有助于疾病的诊断、治疗、预防 途 (2)培育作物新品种 2.植物体细胞杂交与动物细胞融合比较
植物细胞杂交(番茄马铃薯植株) 动物细胞融合(单克隆抗体制备)
第1步 原生质体的制备(酶解法) 正常小鼠的处理(注射灭活抗原)
第2步 原生质体的融合(物化法) 动物细胞融合(物化生法) 过 程 第3步 杂种细胞的筛选和培养 杂交瘤细胞的筛选和培养
第4步 杂种植株鉴定 提纯单克隆抗体(特异性强、灵敏度高)
原理/理论基础 细胞膜的流动性、植物细胞的全能性 细胞膜的流动性、细胞增殖
融合前处理 酶解法除去细胞壁：纤维素酶、果胶酶 注射特定抗原法免疫处理正常小鼠 物理法：电刺激、离心、振动 物化法：与植物相同 促融因子 化学法：聚乙二醇 生物法：灭活的仙台病毒 (1)克服有性远缘杂交不亲和性障碍 ①制备单克隆抗体 意义和用途 (2)培育作物新品种 ②有助于疾病的诊断、治疗、预防
3.制备单克隆抗体时，为什么要选用B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞？
提示：哺乳动物感染抗原后，其体内会形成相应的B淋巴细胞，B淋巴细胞能分泌相应的抗体凝聚或杀死这些抗原。动物在免疫反应的过程中，每一种B淋巴细胞能分泌一种特异性抗体，要想获得大量的特异性抗体，必须使能分泌该单一抗体的B淋巴细胞大量增殖。B淋巴细胞具有产生单一抗体的能力，但不能在体外增殖；骨髓瘤细胞是一种癌细胞，它能在体外培养条件下无限增殖，但不能产生抗体。因此，把一种B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，产生杂交瘤细胞，它会兼有两个亲本细胞的特性──在体外培养条件下能不断增殖，同时能产生出某种特异性的抗体。 4.杂交瘤技术制备单克隆抗体的主要步骤（1）抗原制备；（2）免疫动物； （3)免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备；（4)细胞融合； （5）杂交瘤细胞的选择培养；（6）杂交瘤细胞的筛选；（7）杂交瘤细胞的克隆化； （8）单克隆抗体的检定；（9)分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立；（10）单克隆抗体的大量制备。 5．同种生物精卵结合的保障
卵子透明带上存在精子特异性识别的受体，只允许同种生物的精子与卵子结合。 6．防止多个精子入卵受精的保障
（1）透明带反应：精子穿过放射冠和透明带，在接触卵黄膜的瞬间，会产生阻止后来的精子进入透明带的生理反应，这是防止多精入卵受精的第一道屏障。
（2）卵黄膜封闭作用：精子与卵黄膜接触，精子外膜和卵黄膜融合，精子人卵后，卵黄膜立即发生拒绝其他精子再进入卵内的生理反应，这是防止多精入卵受精的第二道屏障。 7．胚胎移植的时间及要求
（1）牛、羊一般培养到桑椹胚或囊胚，若进行胚胎分割，应选择发育良好、形态正常的桑椹胚或囊胚。对囊胚阶段的
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胚胎进行分割时，要注意将内细胞团均等分割。 （2）人的试管胚胎可在4个细胞阶段移植。 8．几种特殊的生殖方式
名师分析
1.（09全国卷Ⅰ4．）下列关于植物体细胞杂交或植物细胞质遗传的叙述，错误的是 ．．
A．利用植物体细胞杂交技术可克服生殖隔离的限制，培育远缘杂种
B．不同种植物原生质体融合的过程属于植物体细胞杂交过程
C．两个不同品种的紫茉莉杂交，正交、反交所得F1的表现型一致
D．两个不同品种的紫茉莉杂交，F1的遗传物质来自母本的多于来自父本的
解析：植物体细胞杂交可以用两种不同的植物细胞，从而可克服生殖隔离的限制，植物体细胞杂交的过程，实际上是不同植物体细胞的原生质体融合的过程。紫茉莉枝叶的性状的遗传是细胞质遗传，两个不同品种的紫茉莉杂交，正交、反交所得F1的表现型应与母本一致，F1的遗传物质来自母本的多于来自父本的，因为受精卵中的细胞质几乎全部来自母本。故C错误。 答案：C
2.（09浙江卷1．）用动、植物成体的体细胞进行离体培养，下列叙述正确的是
A．都需用CO2培养箱 B．都须用液体培养基 C．都要在无菌条件下进行 D．都可体现细胞的全能性
解析：动、植物成体的体细胞进行离体培养都要在无菌条件下进行，动物成体的体细胞离体培养用液体培养基，不能体现细胞的全能性，植物成体的体细胞离体培养不一定用液体培养基，能体现细胞的全能性。故C正确。 答案：C
3.（09江苏卷8．）下列关于哺乳动物胚胎发育和胚胎工程的叙述，正确的是
A．卵裂期胚胎中细胞数目和有机物总量在不断增加 B．胚胎分割时需将原肠胚的内细胞团均等分割
C．胚胎干细胞具有细胞核大、核仁小和蛋白质合成旺盛等特点
D．胚胎干细胞是一类未分化细胞，可从早期胚胎中分离获取
解析：本题考查胚胎干细胞的知识。A选项卵裂期细胞不断分裂但胚胎体积不变，故细胞数目增多但有机物逐渐消耗而减少;B选项中内细胞团是囊胚时期的，不是原肠胚时期的;C选项胚胎干细胞具有细胞核大、核仁比较大而明显的特点。D选项，胚胎干细胞是全能干细胞，是未分化细胞。 答案：D
4.（09山东卷35.）（8分）（生物一现代生物科技专题） ---------------------------------------------------------精品 文档--------------------------------------------------------------------- 精品文档就在这里
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人类在预防与诊疗传染性疾病过程中，经常使用疫苗和抗体。已知某传染性疾病的病原体为RNA病毒，该病毒表面的A蛋白为主要抗原，且疾苗生产和抗体制备的流程之一如下图： ① ② A基因 受体 提取 DNA A基因 A蛋白 RNA 病毒表达载体 细胞 请回答： 小鼠皮下 （1）过程①代表的是 。 （2）过程②构建A基因表过载体时，必须使用 和 两种工具酶。 小鼠骨髓效应B淋（3）过程③采用的实验技术是 ，获得的X是 。 瘤细胞 巴细胞 ③ （4）对健康人进行该传染病免疫预防时， 可选用图中基因工程生产的 所制备的疫苗。 对该传染病疑似患者确诊时，可以疑似患者体内分离病毒， 与已知病毒进行 比较；或用图中的 进行特异性结合检测。 X 抗A蛋白的 单克隆抗体 解析：本题以图展示了疫苗的生产和单克隆抗体的制备的过程，考察了中心法则、基因工程、动物细胞工程等现代生物科技。
（1）中心法则中，对于少数的以RNA为遗传物质的病毒，其遗传信息的传递过程需要补充的过程有RNA的逆转录和RNA的复制的过程，图中过程①正代表的是逆转录的过程
（2）基因工程的步骤是：目的基因的提取——构建基因表达载体——导入受体细胞——目的基因的检测和表达，其中构建基因表达载体中需要限制酶来切割以获取目的基因，同时需要相同的限制酶切割运载体以获取与目的基因相同的黏性末端，再通过 DNA连接酶连接目的基因和运载体。
（3）过程③是将瘤细胞与B淋巴细胞融合的过程，获得的叫杂交瘤细胞，其具备了瘤细胞的无限增殖的特性和B淋巴细胞的产生抗体的特性，从而制备单克隆抗体。
(4）本题考察了免疫预防的操作过程，以及欲确诊疑似患者而采取的方法。本题中提示该RNA病毒表面的A蛋白为主要的抗原，故而可选用通过基因工程生产的A蛋白制备疫苗；确诊时为判断该病毒是否为题目中的RNA病毒，可以进行核酸序列的比对，也可以利用单克隆抗体具备特异性，利用抗A蛋白的特异性单克隆抗体通过能否特异性结合判断病毒表面是否有A蛋白的存在进一步进行检测是否为目的RNA病毒。 答案：（1）逆转录
（2）限制性核酸内切酶（限制酶、限制性内切酶） DNA连接酶（两空可以互换） （3）细胞融合 杂交瘤细胞
（4） A蛋白 核酸（基因）序列 抗A蛋白的单克隆抗体
5.（09四川卷30.）（22分）回答下列Ⅰ、Ⅱ两个小题。
Ⅰ.将小鼠胚胎干细胞定向诱导分化成一种特定的细胞（命名为M细胞），再将M细胞移植到糖尿病模型小鼠（胰岛细胞被特定药物破坏的小鼠）体内，然后小鼠的血糖浓度，结果如图所示（虚线表示正常小鼠的血糖浓度值）。请回答相关问题：（1）实验用的胚胎干细胞取自小鼠的早期囊胚，取出胚胎后一般用 酶
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